Մետաբոլոմիկա, որը բարձր սպեցիֆիկությամբ տարբերակում է բարորակ և չարորակ թոքային հանգույցները՝ օգտագործելով հիվանդի շիճուկի բարձր լուծաչափով զանգվածային սպեկտրոմետրիկ վերլուծություն։

Համակարգչային շերտագրության (ՀՇ) միջոցով հայտնաբերված թոքային հանգույցների դիֆերենցիալ ախտորոշումը շարունակում է մնալ մարտահրավեր կլինիկական պրակտիկայում: Այստեղ մենք բնութագրում ենք 480 շիճուկային նմուշների գլոբալ մետաբոլոմը, ներառյալ առողջ վերահսկող խմբերը, բարորակ թոքային հանգույցները և I փուլի թոքային ադենոկարցինոման: Ադենոկարցինոմաները ցուցաբերում են եզակի մետաբոլոմիկ պրոֆիլներ, մինչդեռ բարորակ հանգույցները և առողջ անհատները ունեն մեծ նմանություն մետաբոլոմիկ պրոֆիլներում: Հայտնաբերման խմբում (n = 306) նույնականացվել է 27 մետաբոլիտների հավաքածու՝ բարորակ և չարորակ հանգույցները տարբերակելու համար: Ներքին վավերացման (n = 104) և արտաքին վավերացման (n = 111) խմբերում տարբերակող մոդելի AUC-ն համապատասխանաբար կազմել է 0.915 և 0.945: Ուղիների վերլուծությունը բացահայտել է գլիկոլիտիկ մետաբոլիտների աճ, որոնք կապված են թոքային ադենոկարցինոմայի շիճուկում տրիպտոֆանի նվազման հետ՝ համեմատած բարորակ հանգույցների և առողջ վերահսկող խմբերի հետ, և ենթադրել է, որ տրիպտոֆանի կլանումը խթանում է գլիկոլիզը թոքերի քաղցկեղի բջիջներում: Մեր ուսումնասիրությունը ընդգծում է շիճուկային մետաբոլիտների բիոմարկերների արժեքը ՀՇ-ով հայտնաբերված թոքային հանգույցների ռիսկը գնահատելու գործում:
Վաղ ախտորոշումը կարևոր է քաղցկեղով հիվանդների գոյատևման մակարդակի բարելավման համար: ԱՄՆ-ի ազգային թոքերի քաղցկեղի սկրինինգային հետազոտության (NLST) և եվրոպական NELSON ուսումնասիրության արդյունքները ցույց են տվել, որ ցածր դեղաչափով համակարգչային տոմոգրաֆիայի (LDCT) միջոցով սկրինինգը կարող է զգալիորեն նվազեցնել թոքերի քաղցկեղից մահացությունը բարձր ռիսկի խմբերում1,2,3: LDCT-ի լայնորեն կիրառումից ի վեր թոքերի քաղցկեղի սկրինինգի համար, ասիմպտոմատիկ թոքային հանգույցների պատահական ռենտգենագրական հայտնաբերումների հաճախականությունը շարունակել է աճել4: Թոքային հանգույցները սահմանվում են որպես մինչև 3 սմ տրամագծով օջախային մթագնումներ5: Մենք դժվարությունների ենք հանդիպում չարորակ ուռուցքի հավանականությունը գնահատելու և LDCT-ի միջոցով պատահականորեն հայտնաբերված թոքային հանգույցների մեծ թվի հետ գործ ունենալու հարցում: ՀՏ-ի սահմանափակումները կարող են հանգեցնել հաճախակի հետևողական հետազոտությունների և կեղծ դրական արդյունքների, ինչը հանգեցնում է ավելորդ միջամտության և չափազանց բուժման6: Հետևաբար, անհրաժեշտ է մշակել հուսալի և օգտակար բիոմարկերներ՝ թոքերի քաղցկեղը վաղ փուլերում ճիշտ նույնականացնելու և սկզբնական հայտնաբերման ժամանակ բարորակ հանգույցների մեծ մասը տարբերակելու համար7:
Արյան (շիճուկ, պլազմա, ծայրամասային արյան մոնոնուկլեար բջիջներ) համալիր մոլեկուլային վերլուծությունը, ներառյալ գենոմիկան, պրոտեոմիկան կամ ԴՆԹ մեթիլացումը8,9,10, հանգեցրել է թոքերի քաղցկեղի ախտորոշիչ բիոմարկերների հայտնաբերման նկատմամբ հետաքրքրության աճի: Միևնույն ժամանակ, մետաբոլոմիկայի մոտեցումները չափում են բջջային վերջնական արգասիքները, որոնք ազդվում են էնդոգեն և էկզոգեն ազդեցություններից և, հետևաբար, կիրառվում են հիվանդության սկիզբը և արդյունքը կանխատեսելու համար: Հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիան (LC-MS) լայնորեն օգտագործվող մեթոդ է մետաբոլոմիկայի ուսումնասիրությունների համար՝ իր բարձր զգայունության և մեծ դինամիկ տիրույթի շնորհիվ, որը կարող է ընդգրկել տարբեր ֆիզիկաքիմիական հատկություններով մետաբոլիտներ11,12,13: Չնայած պլազմայի/շիճուկի գլոբալ մետաբոլոմիկ վերլուծությունը օգտագործվել է թոքերի քաղցկեղի ախտորոշման14,15,16,17 և բուժման արդյունավետության հետ կապված բիոմարկերները նույնականացնելու համար18, շիճուկային մետաբոլիտների դասակարգիչները՝ բարորակ և չարորակ թոքային հանգույցները տարբերակելու համար, դեռևս շատ ուսումնասիրության կարիք ունեն: - զանգվածային հետազոտություններ:
Ադենոկարցինոման և տափակ բջջային կարցինոման ոչ մանր բջջային թոքերի քաղցկեղի (ՈՓԲՔ) երկու հիմնական ենթատիպերն են: Տարբեր համակարգչային շերտագրության (ՀՏ) սկրինինգային թեստերը ցույց են տալիս, որ ադենոկարցինոման թոքերի քաղցկեղի ամենատարածված հյուսվածաբանական տեսակն է1,19,20,21: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք օգտագործել ենք ուլտրաարդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-բարձր թույլտվության զանգվածային սպեկտրոմետրիա (UPLC-HRMS)՝ մետաբոլոմիկ վերլուծություն կատարելու համար ընդհանուր 695 շիճուկային նմուշների վրա, ներառյալ առողջ վերահսկող խմբերը, բարորակ թոքային հանգույցները և ՀՏ-ով հայտնաբերված ≤3 սմ չափի: I փուլի թոքային ադենոկարցինոմայի սկրինինգ: Մենք բացահայտել ենք շիճուկային մետաբոլիտների մի խումբ, որը տարբերակում է թոքերի ադենոկարցինոման բարորակ հանգույցներից և առողջ վերահսկող խմբերից: Ուղիների հարստացման վերլուծությունը ցույց է տվել, որ տրիպտոֆանի և գլյուկոզի աննորմալ նյութափոխանակությունը թոքերի ադենոկարցինոմայի տարածված փոփոխություններ են՝ համեմատած բարորակ հանգույցների և առողջ վերահսկող խմբերի հետ: Վերջապես, մենք ստեղծել և վավերացրել ենք շիճուկային նյութափոխանակության դասակարգիչ՝ բարձր ճշգրտությամբ և զգայունությամբ՝ LDCT-ով հայտնաբերված չարորակ և բարորակ թոքային հանգույցները տարբերակելու համար, ինչը կարող է օգնել վաղ դիֆերենցիալ ախտորոշմանը և ռիսկի գնահատմանը:
Ընթացիկ ուսումնասիրության մեջ, սեռի և տարիքի համապատասխան շիճուկի նմուշներ են հավաքվել հետահայաց կերպով 174 առողջ վերահսկիչ խմբից, 292 հիվանդից՝ բարորակ թոքային հանգույցներով և 229 հիվանդից՝ I փուլի թոքային ադենոկարցինոմայով: 695 մասնակիցների ժողովրդագրական բնութագրերը ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ 1-ում:
Ինչպես ցույց է տրված նկար 1ա-ում, Սուն Յաթ-սենի համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնում հավաքվել է ընդհանուր առմամբ 480 շիճուկի նմուշ, այդ թվում՝ 174 առողջ վերահսկիչ (HC), 170 բարորակ հանգույցիկ (BN) և 136 I փուլի թոքային ադենոկարցինոմայի (LA) նմուշ: Discovery cohort-ը ոչ թիրախային մետաբոլոմիկ պրոֆիլավորման համար՝ օգտագործելով ուլտրաարդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-բարձր թույլտվության զանգվածային սպեկտրոմետրիա (UPLC-HRMS): Ինչպես ցույց է տրված լրացուցիչ նկար 1-ում, LA-ի և HC-ի, LA-ի և BN-ի միջև դիֆերենցիալ մետաբոլիտները նույնականացվել են դասակարգման մոդել ստեղծելու և դիֆերենցիալ ուղիների վերլուծությունը հետագա ուսումնասիրելու համար: Սուն Յաթ-սենի համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնի կողմից հավաքված 104 նմուշ և երկու այլ հիվանդանոցների կողմից հավաքված 111 նմուշ համապատասխանաբար ենթարկվել են ներքին և արտաքին վավերացման:
ա) Հայտնաբերման կոհորտում ուսումնասիրության բնակչություն, որը ենթարկվել է գլոբալ շիճուկային մետաբոլոմիկայի վերլուծության՝ օգտագործելով ուլտրա-արդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-բարձր լուծաչափի զանգվածային սպեկտրոմետրիա (UPLC-HRMS): բ) Ուսումնասիրության կոհորտից 480 շիճուկային նմուշների ընդհանուր մետաբոլոմի մասնակի նվազագույն քառակուսիների դիսկրիմինանտ վերլուծություն (PLS-DA), ներառյալ առողջ վերահսկիչ խումբը (HC, n = 174), բարորակ հանգույցները (BN, n = 170) և I փուլի թոքերի ադենոկարցինոման (Լոս Անջելես, n = 136): +ESI, դրական էլեկտրոցողման իոնացման ռեժիմ, -ESI, բացասական էլեկտրոցողման իոնացման ռեժիմ: գ–ե Երկու տրված խմբերում զգալիորեն տարբեր առատություններով մետաբոլիտները (երկկողմանի Վիլկոքսոնի նշանային դասակարգման թեստ, կեղծ հայտնաբերման մակարդակի ճշգրտված p արժեք, FDR <0.05) ներկայացված են կարմիրով (ծալքի փոփոխություն > 1.2) և կապույտով (ծալքի փոփոխություն < 0.83): ) ներկայացված է հրաբխի գրաֆիկի վրա: զ) Հիերարխիկ կլաստերային ջերմային քարտեզ, որը ցույց է տալիս LA-ի և BN-ի միջև մեկնաբանված մետաբոլիտների քանակի զգալի տարբերությունները: Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են աղբյուրի տվյալների ֆայլերի տեսքով։
Հայտնաբերման խմբում 174 HC, 170 BN և 136 LA շիճուկային մետաբոլոմի ընդհանուր քանակը վերլուծվել է UPLC-HRMS վերլուծության միջոցով: Մենք նախ ցույց ենք տալիս, որ որակի վերահսկման (QC) նմուշները սերտորեն խմբավորված են չվերահսկվող գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (PCA) մոդելի կենտրոնում, հաստատելով ներկայիս ուսումնասիրության կատարողականի կայունությունը (Լրացուցիչ նկար 2):
Ինչպես ցույց է տրված նկար 1բ-ում ներկայացված մասնակի նվազագույն քառակուսիների դիսկրիմինանտ վերլուծության (PLS-DA) մեջ, մենք պարզեցինք, որ LA-ի և BN-ի, LA-ի և HC-ի միջև կան հստակ տարբերություններ դրական (+ESI) և բացասական (-ESI) էլեկտրոցողման իոնացման ռեժիմներում: Այնուամենայնիվ, BN-ի և HC-ի միջև նշանակալի տարբերություններ չեն հայտնաբերվել +ESI և -ESI պայմաններում:
Մենք հայտնաբերեցինք LA-ի և HC-ի միջև 382 տարբերակիչ հատկանիշ, LA-ի և BN-ի միջև՝ 231 տարբերակիչ հատկանիշ, և BN-ի և HC-ի միջև 95 տարբերակիչ հատկանիշ (Վիլկոքսոնի նշանային դասակարգման թեստ, FDR <0.05 և բազմակի փոփոխություն >1.2 կամ <0.83) (Նկար .1c-e): . Պիկերը լրացուցիչ մեկնաբանվեցին (Լրացուցիչ տվյալներ 3) տվյալների բազայի (mzCloud/HMDB/Chemspider գրադարան) համեմատությամբ՝ m/z արժեքի, պահպանման ժամանակի և ֆրագմենտացիոն զանգվածային սպեկտրի որոնման միջոցով (մանրամասները նկարագրված են «Մեթոդներ» բաժնում)22: Վերջապես, LA-ի և BN-ի (Նկար 1f և Լրացուցիչ աղյուսակ 2) և LA-ի և HC-ի (Լրացուցիչ նկար 3 և Լրացուցիչ աղյուսակ 2) համար համապատասխանաբար նույնականացվեցին 33 և 38 մեկնաբանված մետաբոլիտներ՝ առատության զգալի տարբերություններով: Ի տարբերություն դրա, BN-ում և HC-ում նույնականացվեցին միայն 3 մետաբոլիտ՝ առատության զգալի տարբերություններով (Լրացուցիչ աղյուսակ 2), ինչը համապատասխանում է PLS-DA-ում BN-ի և HC-ի միջև համընկնումին: Այս դիֆերենցիալ մետաբոլիտները ներառում են կենսաքիմիական նյութերի լայն շրջանակ (Լրացուցիչ նկար 4): Ամփոփելով՝ այս արդյունքները ցույց են տալիս շիճուկային մետաբոլոմի զգալի փոփոխություններ, որոնք արտացոլում են վաղ փուլի թոքերի քաղցկեղի չարորակ վերափոխումը՝ համեմատած բարորակ թոքային հանգույցների կամ առողջ անհատների հետ: Միևնույն ժամանակ, BN-ի և HC-ի շիճուկային մետաբոլոմի նմանությունը ենթադրում է, որ բարորակ թոքային հանգույցները կարող են ունենալ բազմաթիվ կենսաբանական բնութագրեր առողջ անհատների հետ: Հաշվի առնելով, որ էպիդերմալ աճի գործոնի ընկալիչի (EGFR) գենի մուտացիաները տարածված են թոքերի ադենոկարցինոմայի 23-րդ ենթատիպում, մենք փորձեցինք որոշել շարժիչ մուտացիաների ազդեցությունը շիճուկային մետաբոլոմի վրա: Այնուհետև մենք վերլուծեցինք թոքերի ադենոկարցինոմայի խմբում EGFR կարգավիճակ ունեցող 72 դեպքերի ընդհանուր մետաբոլոմիկ պրոֆիլը: Հետաքրքիր է, որ PCA վերլուծության մեջ մենք գտանք համեմատելի պրոֆիլներ EGFR մուտանտ հիվանդների (n = 41) և EGFR վայրի տիպի հիվանդների (n = 31) միջև (Լրացուցիչ նկար 5ա): Այնուամենայնիվ, մենք նույնականացրեցինք 7 մետաբոլիտ, որոնց առատությունը զգալիորեն փոխվել էր EGFR մուտացիա ունեցող հիվանդների մոտ՝ համեմատած վայրի տիպի EGFR ունեցող հիվանդների հետ (t թեստ, p < 0.05 և փոփոխությունը > 1.2 կամ < 0.83) (Լրացուցիչ նկար 5բ): Այս մետաբոլիտների մեծ մասը (7-ից 5-ը) ացիլկարնիտիններ են, որոնք կարևոր դեր են խաղում ճարպաթթուների օքսիդացման ուղիներում:
Ինչպես պատկերված է նկար 2ա-ում ներկայացված աշխատանքային հոսքում, հանգույցների դասակարգման բիոմարկերները ստացվել են LA (n = 136) և BN (n = 170)-ում նույնականացված 33 դիֆերենցիալ մետաբոլիտների վրա հիմնված նվազագույն բացարձակ կծկման օպերատորների և ընտրության միջոցով: Փոփոխականների լավագույն համադրություն (LASSO) – երկուական լոգիստիկ ռեգրեսիայի մոդել: Մոդելի հուսալիությունը ստուգելու համար օգտագործվել է տասնապատիկ խաչաձև վավերացում: Փոփոխականների ընտրությունը և պարամետրերի կանոնավորումը ճշգրտվում են հավանականության մաքսիմալացման տույժով՝ λ24 պարամետրով: Գլոբալ մետաբոլոմիկայի վերլուծությունը հետագայում անկախ կերպով իրականացվել է ներքին վավերացման (n = 104) և արտաքին վավերացման (n = 111) խմբերում՝ տարբերակող մոդելի դասակարգման կատարողականը ստուգելու համար: Արդյունքում, հայտնաբերումների հավաքածուի 27 մետաբոլիտներ նույնականացվել են որպես լավագույն տարբերակող մոդել՝ ամենամեծ միջին AUC արժեքով (Նկար 2բ), որոնցից 9-ը LA-ում ունեցել են աճող ակտիվություն, իսկ 18-ը՝ նվազեցված ակտիվություն՝ համեմատած BN-ի հետ (Նկար 2գ):
Թոքային հանգույցների դասակարգչի կառուցման աշխատանքային հոսք, ներառյալ հայտնաբերման հավաքածուում շիճուկային մետաբոլիտների լավագույն վահանակի ընտրությունը՝ օգտագործելով երկուական լոգիստիկ ռեգրեսիայի մոդել՝ տասնապատիկ խաչաձև վավերացման միջոցով, և կանխատեսողական կատարողականի գնահատում ներքին և արտաքին վավերացման հավաքածուներում։ բ LASSO ռեգրեսիայի մոդելի խաչաձև վավերացման վիճակագրություն նյութափոխանակության բիոմարկերների ընտրության համար։ Վերևում տրված թվերը ներկայացնում են տվյալ λ-ում ընտրված բիոմարկերների միջին քանակը։ Կարմիր կետավոր գիծը ներկայացնում է համապատասխան լամբդայի դեպքում AUC-ի միջին արժեքը։ Մոխրագույն սխալի սյուները ներկայացնում են AUC-ի նվազագույն և առավելագույն արժեքները։ Կետավոր գիծը ցույց է տալիս լավագույն մոդելը՝ 27 ընտրված բիոմարկերներով։ AUC՝ ընդունիչի շահագործման բնութագրի (ROC) կորի տակ գտնվող տարածքը։ գ LA խմբում 27 ընտրված մետաբոլիտների ծալքի փոփոխությունները՝ համեմատած հայտնաբերման խմբի BN խմբի հետ։ Կարմիր սյուն՝ ակտիվացում։ Կապույտ սյունը՝ անկում։ դ–զ Ընդունիչի շահագործման բնութագրի (ROC) կորեր, որոնք ցույց են տալիս տարբերակող մոդելի հզորությունը՝ հիմնվելով հայտնաբերման, ներքին և արտաքին վավերացման հավաքածուներում 27 մետաբոլիտների համադրությունների վրա։ Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են աղբյուրի տվյալների ֆայլերի տեսքով։
Այս 27 մետաբոլիտների կշռված ռեգրեսիոն գործակիցների հիման վրա ստեղծվել է կանխատեսման մոդել (Լրացուցիչ աղյուսակ 3): Այս 27 մետաբոլիտների վրա հիմնված ROC վերլուծությունը ցույց է տվել կորի տակ գտնվող մակերեսի (AUC) 0.933 արժեք, հայտնաբերման խմբի զգայունությունը՝ 0.868, իսկ յուրահատկությունը՝ 0.859 (Նկար 2դ): Միևնույն ժամանակ, LA-ի և HC-ի միջև 38 մեկնաբանված դիֆերենցիալ մետաբոլիտների շարքում 16 մետաբոլիտների հավաքածուն հասել է 0.902 AUC-ի՝ 0.801 զգայունությամբ և 0.856 յուրահատկությամբ՝ LA-ն HC-ից տարբերակելու համար (Լրացուցիչ նկար 6ա-գ): Համեմատվել են նաև դիֆերենցիալ մետաբոլիտների տարբեր ծալքի փոփոխության շեմերի վրա հիմնված AUC արժեքները: Մենք պարզել ենք, որ դասակարգման մոդելը լավագույնս է գործել LA-ի և BN (HC)-ի միջև տարբերակման համար, երբ ծալքի փոփոխության մակարդակը սահմանվել է 1.2՝ ընդդեմ 1.5-ի կամ 2.0-ի (Լրացուցիչ նկար 7ա,բ): 27 մետաբոլիտների խմբերի վրա հիմնված դասակարգման մոդելը հետագայում վավերացվել է ներքին և արտաքին կոհորտներում: Ներքին վավերացման դեպքում AUC-ն կազմել է 0.915 (զգայունություն 0.867, յուրահատկություն 0.811) և արտաքին վավերացման դեպքում՝ 0.945 (զգայունություն 0.810, յուրահատկություն 0.979) (Նկար 2ե, զ): Միջլաբորատոր արդյունավետությունը գնահատելու համար արտաքին խմբից վերցված 40 նմուշներ վերլուծվել են արտաքին լաբորատորիայում, ինչպես նկարագրված է «Մեթոդներ» բաժնում: Դասակարգման ճշգրտությունը կազմել է AUC 0.925 (Լրացուցիչ նկար 8): Քանի որ թոքերի տափակ բջջային քաղցկեղը (LUSC) ոչ մանր բջջային թոքերի քաղցկեղի (NSCLC) երկրորդ ամենատարածված ենթատիպն է թոքերի ադենոկարցինոմայից (LUAD) հետո, մենք նաև փորձարկել ենք նյութափոխանակության պրոֆիլների վավերացված պոտենցիալ օգտակարությունը: BN և LUSC-ի 16 դեպք: LUSC-ի և BN-ի միջև տարբերակման AUC-ն կազմել է 0.776 (Լրացուցիչ նկար 9), ինչը ցույց է տալիս LUAD-ի և BN-ի միջև տարբերակման համեմատ ավելի վատ ունակություն:
Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ՀՏ պատկերների վրա հանգույցների չափը դրականորեն կապված է չարորակացման հավանականության հետ և մնում է հանգույցների բուժման հիմնական որոշիչ գործոն25,26,27: NELSON սկրինինգային ուսումնասիրության մեծ խմբի տվյալների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ <5 մմ հանգույցներ ունեցող հիվանդների մոտ չարորակացման ռիսկը նույնիսկ նման էր հանգույցներ չունեցող հիվանդների մոտ չարորակացման ռիսկին28: Հետևաբար, կանոնավոր ՀՏ մոնիթորինգի կարիք ունեցող նվազագույն չափը 5 մմ է, ինչպես խորհուրդ է տալիս Բրիտանական կրծքային բժշկության ընկերությունը (BTS), և 6 մմ, ինչպես խորհուրդ է տալիս Ֆլեյշների ընկերությունը29: Այնուամենայնիվ, 6 մմ-ից մեծ և ակնհայտ բարորակ առանձնահատկություններ չունեցող հանգույցները, որոնք կոչվում են անորոշ թոքային հանգույցներ (IPN), մնում են կլինիկական պրակտիկայում գնահատման և կառավարման հիմնական մարտահրավեր30,31: Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք հանգույցների չափը ազդում է մետաբոլոմիկ ստորագրությունների վրա՝ օգտագործելով հայտնաբերման և ներքին վավերացման խմբերից վերցված նմուշներ: Կենտրոնանալով 27 վավերացված բիոմարկերների վրա, մենք նախ համեմատեցինք HC և BN 6 մմ-ից պակաս մետաբոլոմների PCA պրոֆիլները: Մենք պարզեցինք, որ HC-ի և BN-ի տվյալների մեծ մասը համընկնում էր, ինչը ցույց էր տալիս, որ շիճուկային մետաբոլիտների մակարդակները նման էին երկու խմբերում էլ (Նկար 3ա): Տարբեր չափերի միջակայքերի առանձնահատկությունների քարտեզները պահպանվեցին BN-ում և LA-ում (Նկար 3բ, գ), մինչդեռ չարորակ և բարորակ հանգույցների միջև նկատվեց տարանջատում 6-20 մմ միջակայքում (Նկար 3դ): Այս կոհորտան ուներ AUC 0.927, յուրահատկություն 0.868 և զգայունություն 0.820՝ 6-ից 20 մմ չափի հանգույցների չարորակությունը կանխատեսելու համար (Նկար 3ե, զ): Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ դասակարգիչը կարող է գրանցել վաղ չարորակ տրանսֆորմացիայի հետևանքով առաջացած նյութափոխանակության փոփոխությունները, անկախ հանգույցի չափից:
ad Նշված խմբերի միջև PCA պրոֆիլների համեմատություն՝ հիմնված 27 մետաբոլիտների նյութափոխանակության դասակարգչի վրա: CC և BN < 6 մմ: b BN < 6 մմ ընդդեմ BN 6–20 մմ: LA 6–20 մմ ընդդեմ LA 20–30 մմ: g BN 6–20 մմ և LA 6–20 մմ: GC, n = 174; BN < 6 մմ, n = 153; BN 6–20 մմ, n = 91; LA 6–20 մմ, n = 89; LA 20–30 մմ, n = 77: ե Ընդունիչի շահագործման բնութագրերի (ROC) կորը ցույց է տալիս տարբերակող մոդելի աշխատանքը 6–20 մմ հանգույցների համար: f Հավանականության արժեքները հաշվարկվել են լոգիստիկ ռեգրեսիայի մոդելի հիման վրա՝ 6–20 մմ չափի հանգույցների համար: Մոխրագույն կետավոր գիծը ներկայացնում է օպտիմալ սահմանային արժեքը (0.455): Վերևում նշված թվերը ներկայացնում են Լոս Անջելեսի համար կանխատեսվող դեպքերի տոկոսը: Օգտագործեք երկկողմանի Ստյուդենտի t թեստը: PCA, գլխավոր բաղադրիչների վերլուծություն: AUC-ի կորի տակ գտնվող մակերեսը: Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են աղբյուրի տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Չորս նմուշ (44-61 տարեկան)՝ նմանատիպ թոքային հանգույցների չափսերով (7-9 մմ), հետագայում ընտրվել են չարորակության կանխատեսման առաջարկվող մոդելի արդյունավետությունը պատկերելու համար (Նկար 4ա, բ): Սկզբնական սկրինինգի ժամանակ 1-ին դեպքը ներկայացվել է որպես պինդ հանգույց՝ կալցիֆիկացիայով, որը բարորակության հետ կապված հատկանիշ է, մինչդեռ 2-րդ դեպքը ներկայացվել է որպես անորոշ մասամբ պինդ հանգույց՝ առանց ակնհայտ բարորակ հատկանիշների: Հետագա համակարգչային շերտագրության երեք փուլերը ցույց են տվել, որ այս դեպքերը մնացել են կայուն 4 տարվա ընթացքում և, հետևաբար, համարվել են բարորակ հանգույցներ (Նկար 4ա): Համեմատած շարքային համակարգչային շերտագրության կլինիկական գնահատման հետ, ներկայիս դասակարգիչ մոդելով միանվագ շիճուկային մետաբոլիտների վերլուծությունը արագ և ճիշտ է նույնականացրել այս բարորակ հանգույցները՝ հիմնվելով հավանականության սահմանափակումների վրա (աղյուսակ 1): 3-րդ դեպքի նկար 4բ-ն ցույց է տալիս պլևրալ նահանջի նշաններով հանգույց, որը ամենից հաճախ կապված է չարորակության հետ32: 4-րդ դեպքը ներկայացվել է որպես անորոշ մասամբ պինդ հանգույց՝ առանց բարորակ պատճառի որևէ ապացույցի: Այս բոլոր դեպքերը կանխատեսվել են որպես չարորակ՝ դասակարգչի մոդելի համաձայն (աղյուսակ 1): Թոքերի ադենոկարցինոմայի գնահատումը ցույց է տրվել թոքերի հեռացման վիրահատությունից հետո հյուսվածաբանական հետազոտությամբ (Նկար 4բ): Արտաքին վավերացման հավաքածուի համար նյութափոխանակության դասակարգիչը ճշգրտորեն կանխատեսել է 6 մմ-ից մեծ անորոշ թոքային հանգույցների երկու դեպք (Լրացուցիչ նկար 10):
Երկու բարորակ հանգույցների թոքերի առանցքային պատուհանի համակարգչային տոմոգրաֆիայի (ՀՏ) պատկերներ: 1-ին դեպքում, 4 տարի անց ՀՏ սկանավորումը ցույց տվեց 7 մմ չափի կայուն պինդ հանգույց՝ աջ ստորին բլթում կալցիֆիկացիայով: 2-րդ դեպքում, 5 տարի անց ՀՏ սկանավորումը ցույց տվեց 7 մմ տրամագծով կայուն, մասամբ պինդ հանգույց՝ աջ վերին բլթում: բ. I փուլի ադենոկարցինոմայի երկու դեպքերի թոքերի առանցքային պատուհանի ՀՏ պատկերներ և համապատասխան ախտաբանական հետազոտություններ՝ թոքերի հեռացումից առաջ: 3-րդ դեպքում աջ վերին բլթում հայտնաբերվել է 8 մմ տրամագծով հանգույց՝ պլևրալ նահանջով: 4-րդ դեպքում ձախ վերին բլթում հայտնաբերվել է 9 մմ չափի մասնակի պինդ հղկված ապակու նման հանգույց: Հեռացված թոքային հյուսվածքի հեմատոքսիլինային և էոզինային (H&E) ներկում (մասշտաբի սյուն = 50 մկմ), որը ցույց է տալիս թոքային ադենոկարցինոմայի ացինարային աճի պատկերը: Սլաքները ցույց են տալիս ՀՏ պատկերների վրա հայտնաբերված հանգույցները: H&E պատկերները պաթոլոգի կողմից հետազոտված բազմաթիվ (>3) մանրադիտակային դաշտերի ներկայացուցչական պատկերներ են:
Ամփոփելով՝ մեր արդյունքները ցույց են տալիս շիճուկային մետաբոլիտային բիոմարկերների պոտենցիալ արժեքը թոքային հանգույցների դիֆերենցիալ ախտորոշման մեջ, ինչը կարող է մարտահրավերներ առաջացնել ՀՏ սկրինինգի գնահատման ժամանակ։
Հիմնվելով վավերացված դիֆերենցիալ մետաբոլիտների վահանակի վրա, մենք ձգտեցինք բացահայտել հիմնական նյութափոխանակության փոփոխությունների կենսաբանական համահարաբերակցությունները: MetaboAnalyst-ի կողմից KEGG ուղիների հարստացման վերլուծությունը բացահայտեց 6 ընդհանուր նշանակալիորեն փոփոխված ուղիներ տվյալ երկու խմբերի միջև (LA vs. HC և LA vs. BN, ճշգրտված p ≤ 0.001, էֆեկտ > 0.01): Այս փոփոխությունները բնութագրվում էին պիրուվատի նյութափոխանակության, տրիպտոֆանի նյութափոխանակության, նիացինի և նիկոտինամիդի նյութափոխանակության, գլիկոլիզի, TCA ցիկլի և պուրինի նյութափոխանակության խանգարումներով (Նկար 5ա): Այնուհետև մենք լրացուցիչ իրականացրեցինք թիրախային մետաբոլոմիկա՝ հիմնական փոփոխությունները բացարձակ քանակականացման միջոցով ստուգելու համար: Հաճախ փոփոխված ուղիներում ընդհանուր մետաբոլիտների որոշումը եռակի քառաբևեռ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (QQQ) միջոցով՝ օգտագործելով իսկական մետաբոլիտների ստանդարտներ: Մետաբոլոմիկայի ուսումնասիրության թիրախային նմուշի ժողովրդագրական բնութագրերը ներառված են լրացուցիչ աղյուսակ 4-ում: Մեր գլոբալ մետաբոլոմիկայի արդյունքներին համապատասխան, քանակական վերլուծությունը հաստատեց, որ հիպոքսանտինը և քսանտինը, պիրուվատը և լակտատը LA-ում ավելացել են BN-ի և HC-ի համեմատ (Նկար 5բ, գ, p <0.05): Այնուամենայնիվ, BN-ի և HC-ի միջև այս մետաբոլիտների էական տարբերություններ չեն հայտնաբերվել:
KEGG ուղու հարստացման վերլուծություն LA խմբում զգալիորեն տարբեր մետաբոլիտների՝ համեմատած BN և HC խմբերի հետ: Օգտագործվել է երկկողմանի Globaltest, և p արժեքները ճշգրտվել են Հոլմ-Բոնֆերոնի մեթոդով (կարգավորված p ≤ 0.001 և էֆեկտի չափ > 0.01): b–d Ջութակի գրաֆիկները ցույց են տալիս հիպոքսանտինի, քսանտինի, լակտատի, պիրուվատի և տրիպտոֆանի մակարդակները շիճուկային HC, BN և LA-ում, որոշված ​​LC-MS/MS-ով (n = 70 մեկ խմբի համար): Սպիտակ և սև կետավոր գծերը համապատասխանաբար ցույց են տալիս միջնարժեքը և քվարտիլը: ե Ջութակի գրաֆիկը ցույց է տալիս SLC7A5-ի և QPRT-ի նորմալացված Log2TPM (տրանսկրիպտներ միլիոնի հաշվով) mRNA էքսպրեսիան թոքերի ադենոկարցինոմայում (n = 513)՝ համեմատած նորմալ թոքային հյուսվածքի (n = 59) հետ LUAD-TCGA տվյալների հավաքածուում: Սպիտակ վանդակը ներկայացնում է միջքառորդային միջակայքը, կենտրոնում հորիզոնական սև գիծը ներկայացնում է միջնարժեքը, իսկ վանդակից դուրս եկող ուղղահայաց սև գիծը ներկայացնում է 95% վստահության միջակայքը (CI): f TCGA տվյալների հավաքածուում թոքերի ադենոկարցինոմայի (n = 513) և նորմալ թոքային հյուսվածքի (n = 59) SLC7A5-ի և GAPDH-ի արտահայտման Պիրսոնի կորելյացիոն գրաֆիկը: Մոխրագույն տարածքը ներկայացնում է 95% CI-ն: r, Պիրսոնի կորելյացիայի գործակից: g LC-MS/MS մեթոդով որոշված ​​ոչ սպեցիֆիկ shRNA վերահսկիչով (NC) և shSLC7A5-ով (Sh1, Sh2) տրանսֆեկտված A549 բջիջներում նորմալացված բջջային տրիպտոֆանի մակարդակները: Ներկայացվում է յուրաքանչյուր խմբի հինգ կենսաբանորեն անկախ նմուշների վիճակագրական վերլուծությունը: h NADt-ի (ընդհանուր NAD, ներառյալ NAD+ և NADH) բջջային մակարդակները A549 բջիջներում (NC) և SLC7A5 նոկդաուն A549 բջիջներում (Sh1, Sh2): Ներկայացվում է յուրաքանչյուր խմբի երեք կենսաբանորեն անկախ նմուշների վիճակագրական վերլուծությունը: i A549 բջիջների գլիկոլիտիկ ակտիվությունը SLC7A5-ի նոկդաունից առաջ և հետո չափվել է արտաբջջային թթվայնացման արագությամբ (ECAR) (n = 4 կենսաբանորեն անկախ նմուշ մեկ խմբում): 2-DG,2-դեօքսի-D-գլյուկոզ: (b–h)-ում օգտագործվել է երկկողմանի Ստյուդենտի t թեստը: (g–i)-ում սխալի սյուները ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը, յուրաքանչյուր փորձ կատարվել է երեք անգամ անկախ, և արդյունքները նման են եղել: Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են աղբյուրի տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Հաշվի առնելով տրիպտոֆանի նյութափոխանակության փոփոխության զգալի ազդեցությունը LA խմբում, մենք նաև գնահատեցինք շիճուկային տրիպտոֆանի մակարդակը HC, BN և LA խմբերում՝ օգտագործելով QQQ: Մենք պարզեցինք, որ շիճուկային տրիպտոֆանը նվազել էր LA-ում՝ համեմատած HC-ի կամ BN-ի հետ (p < 0.001, նկար 5d), ինչը համապատասխանում է նախորդ արդյունքներին, որ թոքերի քաղցկեղով հիվանդների մոտ շրջանառվող տրիպտոֆանի մակարդակն ավելի ցածր է, քան վերահսկիչ խմբի առողջ վերահսկիչ խմբի մոտ33,34,35: PET/CT 11C-մեթիլ-L-տրիպտոֆան ցուցիչ օգտագործող մեկ այլ ուսումնասիրություն ցույց տվեց, որ թոքերի քաղցկեղի հյուսվածքում տրիպտոֆանի ազդանշանի պահպանման ժամանակը զգալիորեն ավելացել էր՝ համեմատած բարորակ վնասվածքների կամ նորմալ հյուսվածքի հետ36: Մենք ենթադրում ենք, որ LA շիճուկում տրիպտոֆանի նվազումը կարող է արտացոլել թոքերի քաղցկեղի բջիջների կողմից տրիպտոֆանի ակտիվ կլանումը:
Հայտնի է նաև, որ տրիպտոֆանի կատաբոլիզմի կինուրինային ուղու վերջնական արգասիքը՝ NAD+37,38-ն է, որը կարևոր սուբստրատ է գլիցերալդեհիդ-3-ֆոսֆատի և 1,3-բիսֆոսֆոգլիցերատի ռեակցիայի համար գլիկոլիզի ժամանակ39: Մինչ նախորդ ուսումնասիրությունները կենտրոնացած էին տրիպտոֆանի կատաբոլիզմի դերի վրա իմունային կարգավորման մեջ, մենք ձգտել ենք պարզաբանել տրիպտոֆանի դիսռեգուլյացիայի և գլիկոլիտիկ ուղիների փոխազդեցությունը, որը դիտարկվել է ներկայիս ուսումնասիրության մեջ: Լուծույթների փոխադրիչների ընտանիքի 7-րդ անդամ 5-ը (SLC7A5) հայտնի է որպես տրիպտոֆանի փոխադրիչ43,44,45: Քվինոլինային թթվի ֆոսֆորիբոզիլտրանսֆերազը (QPRT) կինուրինային ուղուց ներքև գտնվող ֆերմենտ է, որը քվինոլինային թթուն փոխակերպում է NAMN46-ի: LUAD TCGA տվյալների հավաքածուի ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ և՛ SLC7A5-ը, և՛ QPRT-ը զգալիորեն բարձրացված էին ուռուցքային հյուսվածքում՝ համեմատած նորմալ հյուսվածքի հետ (Նկար 5ե): Այս աճը նկատվել է թոքերի ադենոկարցինոմայի I և II փուլերում, ինչպես նաև III և IV փուլերում (Լրացուցիչ նկար 11), ինչը վկայում է տրիպտոֆանի նյութափոխանակության վաղ խանգարումների մասին, որոնք կապված են ուռուցքագոյացման հետ։
Բացի այդ, LUAD-TCGA տվյալների հավաքածուն ցույց տվեց դրական կապ SLC7A5-ի և GAPDH mRNA արտահայտման միջև քաղցկեղով հիվանդների նմուշներում (r = 0.45, p = 1.55E-26, նկար 5f): Ի տարբերություն դրա, նորմալ թոքային հյուսվածքում նման գեների ստորագրությունների միջև նշանակալի կապ չի հայտնաբերվել (r = 0.25, p = 0.06, նկար 5f): SLC7A5-ի (Լրացուցիչ նկար 12) նոկդաունը A549 բջիջներում զգալիորեն նվազեցրել է բջջային տրիպտոֆանի և NAD(H) մակարդակները (Նկար 5g,h), ինչը հանգեցրել է գլիկոլիտիկ ակտիվության թուլացման, որը չափվում է արտաբջջային թթվայնացման արագությամբ (ECAR) (Նկար 1): 5i): Այսպիսով, հիմնվելով շիճուկի նյութափոխանակության փոփոխությունների և in vitro հայտնաբերման վրա, մենք ենթադրում ենք, որ տրիպտոֆանի նյութափոխանակությունը կարող է առաջացնել NAD+ կինուրենինի ուղու միջոցով և կարևոր դեր խաղալ գլիկոլիզի խթանման գործում թոքերի քաղցկեղի դեպքում:
Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ LDCT-ով հայտնաբերված անորոշ թոքային հանգույցների մեծ քանակը կարող է հանգեցնել լրացուցիչ հետազոտությունների, ինչպիսիք են PET-CT-ն, թոքերի բիոպսիան և չափազանց բուժումը՝ չարորակ ուռուցքի կեղծ դրական ախտորոշման պատճառով:31 Ինչպես ցույց է տրված նկար 6-ում, մեր ուսումնասիրությունը բացահայտել է շիճուկային մետաբոլիտների մի խումբ, որն ունի պոտենցիալ ախտորոշիչ արժեք, որը կարող է բարելավել ՀՏ-ով հայտնաբերված թոքային հանգույցների ռիսկի շերտավորումը և հետագա կառավարումը:
Թոքային հանգույցները գնահատվում են ցածր դեղաչափով համակարգչային տոմոգրաֆիայի (LDCT) միջոցով՝ բարորակ կամ չարորակ պատճառների մասին ենթադրող պատկերագրական հատկանիշներով: Հանգույցների անորոշ արդյունքը կարող է հանգեցնել հաճախակի հետազոտման այցելությունների, ավելորդ միջամտությունների և չափազանց բուժման: Ախտորոշիչ արժեք ունեցող շիճուկային նյութափոխանակության դասակարգիչների ներառումը կարող է բարելավել թոքային հանգույցների ռիսկի գնահատումը և հետագա կառավարումը: ՊԷՏ պոզիտրոնային էմիսիոն տոմոգրաֆիա:
ԱՄՆ NLST և եվրոպական NELSON ուսումնասիրությունների տվյալները ենթադրում են, որ բարձր ռիսկի խմբերի ցածր դեղաչափով համակարգչային տոմոգրաֆիայի (LDCT) միջոցով սկրինինգը կարող է նվազեցնել թոքերի քաղցկեղից մահացությունը1,3: Այնուամենայնիվ, LDCT-ով հայտնաբերված պատահական թոքային հանգույցների մեծ թվով ռիսկի գնահատումը և հետագա կլինիկական կառավարումը մնում են ամենաբարդը: Հիմնական նպատակն է օպտիմալացնել LDCT-ի վրա հիմնված առկա արձանագրությունների ճիշտ դասակարգումը՝ ներառելով հուսալի բիոմարկերներ:
Որոշակի մոլեկուլային բիոմարկերներ, ինչպիսիք են արյան մետաբոլիտները, հայտնաբերվել են թոքերի քաղցկեղը առողջ վերահսկիչ խմբի հետ համեմատելով15,17: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք կենտրոնացել ենք շիճուկային մետաբոլոմիկայի վերլուծության կիրառման վրա՝ LDCT-ով պատահաբար հայտնաբերված բարորակ և չարորակ թոքային հանգույցները տարբերակելու համար: Մենք համեմատել ենք առողջ վերահսկիչ խմբի (HC), բարորակ թոքային հանգույցների (BN) և I փուլի թոքային ադենոկարցինոմայի (LA) նմուշների գլոբալ շիճուկային մետաբոլոմը՝ օգտագործելով UPLC-HRMS վերլուծությունը: Մենք պարզել ենք, որ HC-ն և BN-ն ունեին նմանատիպ նյութափոխանակության պրոֆիլներ, մինչդեռ LA-ն ցույց էր տալիս նշանակալի փոփոխություններ HC-ի և BN-ի համեմատ: Մենք բացահայտել ենք շիճուկային մետաբոլիտների երկու հավաքածու, որոնք տարբերակում են LA-ն HC-ից և BN-ից:
Բարորակ և չարորակ հանգույցների ներկայիս LDCT-ի վրա հիմնված նույնականացման սխեման հիմնականում հիմնված է հանգույցների չափի, խտության, ձևաբանության և ժամանակի ընթացքում աճի տեմպի վրա30: Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ հանգույցների չափը սերտորեն կապված է թոքերի քաղցկեղի առաջացման հավանականության հետ: Նույնիսկ բարձր ռիսկի խմբում գտնվող հիվանդների մոտ, 6 մմ-ից պակաս հանգույցների դեպքում չարորակացման ռիսկը <1% է: 6-ից 20 մմ չափի հանգույցների չարորակացման ռիսկը տատանվում է 8%-ից մինչև 64%30: Հետևաբար, Ֆլեյշների ընկերությունը խորհուրդ է տալիս սահմանային տրամագիծը 6 մմ՝ համակարգչային շերտագրության (ՀՏ) ռուտինային հետազոտության համար:29 Այնուամենայնիվ, 6 մմ-ից մեծ անորոշ թոքային հանգույցների (ԹԹՆ) ռիսկի գնահատումը և կառավարումը բավարար չափով չեն իրականացվել31: Սրտի բնածին արատների ներկայիս կառավարումը սովորաբար հիմնված է զգոն սպասման վրա՝ հաճախակի ՀՏ մոնիթորինգով:
Հաստատված մետաբոլոմի հիման վրա մենք առաջին անգամ ցույց տվեցինք մետաբոլոմիկ ստորագրությունների համընկնումը առողջ անհատների և <6 մմ բարորակ հանգույցների միջև: Կենսաբանական նմանությունը համապատասխանում է նախորդ համակարգչային շերտագրության արդյունքներին, որոնք ցույց էին տալիս, որ <6 մմ հանգույցների չարորակացման ռիսկը նույնքան ցածր է, որքան հանգույցներ չունեցող անձանց մոտ:30 Պետք է նշել, որ մեր արդյունքները նաև ցույց են տալիս, որ <6 մմ և ≥6 մմ բարորակ հանգույցները մեծ նմանություն ունեն մետաբոլոմիկ պրոֆիլներում, ինչը ենթադրում է, որ բարորակ էթիոլոգիայի ֆունկցիոնալ սահմանումը համապատասխան է՝ անկախ հանգույցի չափից: Այսպիսով, ժամանակակից ախտորոշիչ շիճուկային մետաբոլիտների վահանակները կարող են ապահովել մեկ վերլուծություն որպես բացառման թեստ, երբ հանգույցները սկզբնապես հայտնաբերվում են համակարգչային շերտագրության վրա և հնարավոր է՝ նվազեցնել սերիական մոնիթորինգը: Միևնույն ժամանակ, նյութափոխանակության բիոմարկերների նույն վահանակը տարբերակում է ≥6 մմ չափի չարորակ հանգույցները բարորակ հանգույցներից և ճշգրիտ կանխատեսումներ է տվել նմանատիպ չափի և երկիմաստ ձևաբանական առանձնահատկությունների IPN-ների համար համակարգչային շերտագրության պատկերների վրա: Այս շիճուկային նյութափոխանակության դասակարգիչը լավ է գործել ≥6 մմ հանգույցների չարորակացման կանխատեսման գործում՝ AUC 0.927-ով: Ամփոփելով՝ մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ շիճուկային եզակի մետաբոլոմիկ ստորագրությունները կարող են հատուկ արտացոլել ուռուցքի վաղ առաջացրած նյութափոխանակության փոփոխությունները և ունենալ պոտենցիալ արժեք որպես ռիսկի կանխատեսող գործոններ՝ անկախ հանգույցների չափից։
Հատկանշական է, որ թոքերի ադենոկարցինոման (LUAD) և տափակ բջջային կարցինոման (LUSC) ոչ մանր բջջային թոքերի քաղցկեղի (NSCLC) հիմնական տեսակներն են: Հաշվի առնելով, որ LUSC-ն ուժեղ կապված է ծխախոտի օգտագործման հետ47, և LUAD-ը համակարգչային տոմոգրաֆիայի միջոցով հայտնաբերված պատահական թոքային հանգույցների ամենատարածված հյուսվածաբանությունն է48, մեր դասակարգչի մոդելը հատուկ կառուցվել է I փուլի ադենոկարցինոմայի նմուշների համար: Վանը և նրա գործընկերները նաև կենտրոնացել են LUAD-ի վրա և լիպիդոմիկայի միջոցով նույնականացրել են ինը լիպիդային ստորագրություններ՝ վաղ փուլի թոքերի քաղցկեղը առողջ անհատներից տարբերակելու համար17: Մենք փորձարկել ենք ներկայիս դասակարգչի մոդելը I փուլի LUSC-ի 16 դեպքերի և 74 բարորակ հանգույցների վրա և նկատել ենք LUSC-ի ցածր կանխատեսման ճշգրտություն (AUC 0.776), ինչը ենթադրում է, որ LUAD-ը և LUSC-ն կարող են ունենալ իրենց սեփական նյութափոխանակային ստորագրությունները: Իրոք, ցույց է տրվել, որ LUAD-ը և LUSC-ն տարբերվում են էթիոլոգիայով, կենսաբանական ծագմամբ և գենետիկական շեղումներով49: Հետևաբար, սկրինինգային ծրագրերում թոքերի քաղցկեղի բնակչության վրա հիմնված հայտնաբերման ուսումնական մոդելներում պետք է ներառվեն հյուսվածաբանության այլ տեսակներ:
Այստեղ մենք բացահայտել ենք թոքերի ադենոկարցինոմայի վեց ամենահաճախ փոփոխվող ուղիները՝ համեմատած առողջ վերահսկիչ խմբի և բարորակ հանգույցների հետ։ Քսանթինը և հիպոքսանտինը պուրինային նյութափոխանակության ուղու տարածված մետաբոլիտներ են։ Մեր արդյունքներին համապատասխան, պուրինային նյութափոխանակության հետ կապված միջանկյալ նյութերը զգալիորեն աճել են թոքերի ադենոկարցինոմայով հիվանդների շիճուկում կամ հյուսվածքներում՝ համեմատած առողջ վերահսկիչ խմբի կամ նախաինվազիվ փուլում գտնվող հիվանդների հետ15,50։ Արյան շիճուկում քսանթինի և հիպոքսանտինի բարձր մակարդակները կարող են արտացոլել արագ բազմացող քաղցկեղի բջիջների կողմից պահանջվող անաբոլիզմը։ Գլյուկոզի նյութափոխանակության դիսռեգուլյացիան քաղցկեղի նյութափոխանակության հայտնի առանձնահատկություն է51։ Այստեղ մենք նկատել ենք պիրուվատի և լակտատի զգալի աճ LA խմբում՝ համեմատած HC և BN խմբի հետ, ինչը համապատասխանում է ոչ մանր բջջային թոքերի քաղցկեղով (NSCLC) հիվանդների և առողջ վերահսկիչ խմբի շիճուկային մետաբոլոմների պրոֆիլներում գլիկոլիտիկ ուղու անոմալիաների վերաբերյալ նախկինում հրապարակված հաղորդագրությունների հետ։ Արդյունքները համապատասխանում են52,53։
Կարևոր է նշել, որ մենք թոքերի ադենոկարցինոմաների շիճուկում նկատել ենք պիրուվատի և տրիպտոֆանի նյութափոխանակության միջև հակադարձ կապ: Արյան շիճուկում տրիպտոֆանի մակարդակը նվազել էր LA խմբում՝ համեմատած HC կամ BN խմբի հետ: Հետաքրքիր է, որ հեռանկարային խմբի մասնակցությամբ նախորդ լայնածավալ ուսումնասիրությունը պարզել է, որ շրջանառվող տրիպտոֆանի ցածր մակարդակը կապված է թոքերի քաղցկեղի առաջացման ռիսկի բարձրացման հետ54: Տրիպտոֆանը էական ամինաթթու է, որը մենք ամբողջությամբ ստանում ենք սննդից: Մենք եզրակացնում ենք, որ թոքերի ադենոկարցինոմայի դեպքում շիճուկում տրիպտոֆանի նվազումը կարող է արտացոլել այս մետաբոլիտի արագ նվազումը: Հայտնի է, որ կինուրենինի ուղու միջոցով տրիպտոֆանի կատաբոլիզմի վերջնական արգասիք de novo NAD+ սինթեզի աղբյուրն է: Քանի որ NAD+-ը հիմնականում արտադրվում է փրկարարական ուղու միջոցով, NAD+-ի կարևորությունը տրիպտոֆանի նյութափոխանակության մեջ առողջության և հիվանդության դեպքում դեռևս պարզ չէ46: TCGA տվյալների բազայի մեր վերլուծությունը ցույց տվեց, որ տրիպտոֆանի փոխադրիչ 7A5 (SLC7A5) լուծույթ փոխադրիչի էքսպրեսիան զգալիորեն բարձրացել է թոքերի ադենոկարցինոմայի մոտ՝ համեմատած նորմալ վերահսկիչ խմբի հետ, և դրականորեն կապված է եղել գլիկոլիտիկ GAPDH ֆերմենտի էքսպրեսիայի հետ: Նախորդ ուսումնասիրությունները հիմնականում կենտրոնացել են տրիպտոֆանի կատաբոլիզմի դերի վրա հակաուռուցքային իմունային պատասխանի ճնշման գործում40,41,42: Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս, որ թոքերի քաղցկեղի բջիջներում SLC7A5-ի նոկդաունի միջոցով տրիպտոֆանի կլանման արգելակումը հանգեցնում է բջջային NAD մակարդակի հետագա նվազմանը և գլիկոլիտիկ ակտիվության միաժամանակյա թուլացմանը: Ամփոփելով՝ մեր ուսումնասիրությունը կենսաբանական հիմք է տալիս թոքերի ադենոկարցինոմայի չարորակ վերափոխման հետ կապված շիճուկային նյութափոխանակության փոփոխությունների համար:
EGFR մուտացիաները ամենատարածված շարժիչ մուտացիաներն են ոչ մանր բջջային քաղցկեղով հիվանդների մոտ: Մեր ուսումնասիրության մեջ մենք պարզեցինք, որ EGFR մուտացիա ունեցող հիվանդները (n = 41) ունեին ընդհանուր մետաբոլոմիկ պրոֆիլներ, որոնք նման էին վայրի տիպի EGFR ունեցող հիվանդներին (n = 31), չնայած մենք հայտնաբերեցինք EGFR մուտանտ ունեցող որոշ հիվանդների շիճուկային մակարդակների նվազում ացիլկարնիտինով հիվանդների մոտ: Ացիլկարնիտինների հաստատված գործառույթը ացիլ խմբերը ցիտոպլազմայից միտոքոնդրիալ մատրից տեղափոխելն է, ինչը հանգեցնում է ճարպաթթուների օքսիդացմանը՝ էներգիա արտադրելու համար 55: Մեր արդյունքներին համապատասխան, վերջերս կատարված ուսումնասիրությունը նույնպես նույնականացրել է EGFR մուտանտի և EGFR վայրի տիպի ուռուցքների միջև մետաբոլոմների պրոֆիլներ՝ վերլուծելով թոքերի ադենոկարցինոմայի 102 հյուսվածքների նմուշների գլոբալ մետաբոլոմը 50: Հետաքրքիր է, որ ացիլկարնիտինի պարունակություն հայտնաբերվել է նաև EGFR մուտանտ խմբում: Հետևաբար, թե արդյոք ացիլկարնիտինի մակարդակի փոփոխությունները արտացոլում են EGFR-ի առաջացրած նյութափոխանակության փոփոխությունները և հիմքում ընկած մոլեկուլային ուղիները, կարող է արժանի լինել հետագա ուսումնասիրության:
Ամփոփելով՝ մեր ուսումնասիրությունը սահմանում է շիճուկային նյութափոխանակության դասակարգիչ թոքային հանգույցների դիֆերենցիալ ախտորոշման համար և առաջարկում է աշխատանքային գործընթաց, որը կարող է օպտիմալացնել ռիսկի գնահատումը և հեշտացնել կլինիկական կառավարումը՝ հիմնվելով համակարգչային շերտագրության (ՀՏ) սկրինինգի վրա։
Այս ուսումնասիրությունը հաստատվել է Սուն Յաթ-սենի համալսարանի քաղցկեղի հիվանդանոցի էթիկայի կոմիտեի, Սուն Յաթ-սենի համալսարանի առաջին դուստր հիվանդանոցի և Չժենչժոուի համալսարանի քաղցկեղի հիվանդանոցի էթիկայի կոմիտեի կողմից: Հայտնաբերման և ներքին վավերացման խմբերում Սուն Յաթ-սենի համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնում քաղցկեղի վերահսկման և կանխարգելման բաժանմունքում տարեկան բժշկական զննումներ անցնող անհատներից հավաքվել է առողջ անհատների 174 շիճուկ և բարորակ հանգույցներից 244 շիճուկ, ինչպես նաև բարորակ հանգույցներից 166 շիճուկ: I փուլի թոքերի ադենոկարցինոմաներ հավաքվել են Սուն Յաթ-սենի համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնից: Արտաքին վավերացման խմբում Սուն Յաթ-սենի համալսարանի առաջին դուստր հիվանդանոցից եղել է բարորակ հանգույցների 48 դեպք, I փուլի թոքերի ադենոկարցինոմայի 39 դեպք և Չժենչժոուի քաղցկեղի հիվանդանոցից՝ I փուլի թոքերի ադենոկարցինոմայի 24 դեպք: Սուն Յաթ-սենի համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնը նաև հավաքել է I փուլի տափակ բջջային թոքերի քաղցկեղի 16 դեպք՝ սահմանված նյութափոխանակության դասակարգչի ախտորոշիչ կարողությունը ստուգելու համար (հիվանդի բնութագրերը ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ 5-ում): Հայտնաբերման խմբից և ներքին վավերացման խմբից նմուշները հավաքվել են 2018 թվականի հունվարից մինչև 2020 թվականի մայիսը։ Արտաքին վավերացման խմբի նմուշները հավաքվել են 2021 թվականի օգոստոսից մինչև 2022 թվականի հոկտեմբերը։ Սեռային կողմնակալությունը նվազագույնի հասցնելու համար յուրաքանչյուր խմբին հատկացվել են մոտավորապես հավասար թվով տղամարդիկ և կանայք։ Հայտնաբերման թիմ և ներքին վերանայման թիմ։ Մասնակցի սեռը որոշվել է ինքնագնահատման հիման վրա։ Բոլոր մասնակիցներից ստացվել է տեղեկացված համաձայնություն, և որևէ փոխհատուցում չի տրամադրվել։ Բարորակ հանգույցներով հիվանդները նրանք էին, ովքեր վերլուծության պահին 2-ից 5 տարի անց կայուն համակարգչային տոմոգրաֆիայի արդյունք ունեին, բացառությամբ արտաքին վավերացման նմուշից վերցված 1 դեպքի, որը հավաքվել էր վիրահատությունից առաջ և ախտորոշվել էր հյուսվածաբանական հետազոտության միջոցով։ Բացառությամբ քրոնիկ բրոնխիտի։ Թոքերի ադենոկարցինոմայի դեպքերը հավաքվել են թոքերի հեռացումից առաջ և հաստատվել են պաթոլոգիական ախտորոշմամբ։ Սովից արյան նմուշները հավաքվել են շիճուկի բաժանման խողովակներում՝ առանց որևէ հակակոագուլյանտի։ Արյան նմուշները մակարդվել են 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում, ապա ցենտրիֆուգացվել են 2851 × g-ով 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում՝ շիճուկի վերին շերտը հավաքելու համար։ Արյան շիճուկի ալիքվոտները սառեցվել են -80°C ջերմաստիճանում մինչև մետաբոլիտների արդյունահանումը: Սուն Յաթ-սենի համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնի քաղցկեղի կանխարգելման և բժշկական զննման բաժանմունքը 100 առողջ դոնորներից հավաքել է շիճուկի մի ամբողջ հավաքածու, այդ թվում՝ 40-ից 55 տարեկան հավասար թվով տղամարդկանց և կանանց: Դոնորների յուրաքանչյուր նմուշի հավասար ծավալներ խառնվել են, ստացված մի ամբողջ հավաքածուն ալիքվոտավորվել և պահվել է -80°C ջերմաստիճանում: Արյան շիճուկի խառնուրդն օգտագործվել է որպես որակի վերահսկման և տվյալների ստանդարտացման համար հղման նյութ:
Հղման շիճուկը և փորձարկման նմուշները հալեցվել են, իսկ մետաբոլիտները արդյունահանվել են համակցված արդյունահանման մեթոդով (MTBE/մեթանոլ/ջուր)56: Հակիրճ ասած, շիճուկի 50 մկլ խառնվել է 225 մկլ սառցե մեթանոլի և 750 մկլ սառցե մեթիլ tert-բուտիլ եթերի (MTBE) հետ: Խառնուրդը խառնել և ինկուբացել սառույցի վրա 1 ժամ: Այնուհետև նմուշները խառնվել են և մրրկային խառնվել 188 մկլ MS կարգի ջրի հետ, որը պարունակում է ներքին ստանդարտներ (13C-լակտատ, 13C3-պիրուվատ, 13C-մեթիոնին և 13C6-իզոլեյցին, որոնք ձեռք են բերվել Cambridge Isotope Laboratories-ից): Այնուհետև խառնուրդը ցենտրիֆուգացվել է 15,000 × g-ով 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում, իսկ ստորին փուլը տեղափոխվել է երկու խողովակների մեջ (յուրաքանչյուրը 125 մկլ)՝ LC-MS վերլուծության դրական և բացասական ռեժիմներով: Վերջապես, նմուշը գոլորշիացվել է մինչև չորանալը բարձր արագությամբ վակուումային կոնցենտրատորում:
Չորացրած մետաբոլիտները վերականգնվել են 120 մկլ 80% ացետոնիտրիլի մեջ, պտտեցվել են 5 րոպե և ցենտրիֆուգացվել 15,000 × g-ով 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում: Վերին շերտերը տեղափոխվել են սաթագույն ապակե սրվակների մեջ՝ միկրոներդիրներով՝ մետաբոլոմիկայի ուսումնասիրությունների համար: Աննպատակային մետաբոլոմիկայի վերլուծություն՝ ուլտրաարդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի-բարձր լուծաչափի զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (UPLC-HRMS) հարթակի վրա: Մետաբոլիտները բաժանվել են Dionex Ultimate 3000 UPLC համակարգի և ACQUITY BEH ամիդային սյան (2.1 × 100 մմ, 1.7 մկմ, Waters) միջոցով: Դրական իոնային ռեժիմում շարժական փուլերը կազմել են 95% (A) և 50% ացետոնիտրիլ (B), որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է 10 մմոլ/լ ամոնիումի ացետատ և 0.1% մրջնաթթու: Բացասական ռեժիմում շարժական A և B փուլերը պարունակում էին համապատասխանաբար 95% և 50% ացետոնիտրիլ, երկու փուլերն էլ պարունակում էին 10 մմոլ/լ ամոնիումի ացետատ, pH = 9: Գրադիենտային ծրագիրը հետևյալն էր՝ 0–0.5 րոպե, 2% B; 0.5–12 րոպե, 2–50% B; 12–14 րոպե, 50–98% B; 14–16 րոպե, 98% B; 16–16.1 րոպե, 98–2% B; 16.1–20 րոպե, 2% B: Սյունը պահպանվել է 40°C ջերմաստիճանում, իսկ նմուշը՝ 10°C ջերմաստիճանում՝ ավտոնմուշառիչում: Հոսքի արագությունը կազմել է 0.3 մլ/րոպե, ներարկման ծավալը՝ 3 մկլ: Էլեկտրասփրեյ իոնացման (ESI) աղբյուրով Q-Exactive Orbitrap զանգվածային սպեկտրոմետրը (Thermo Fisher Scientific) աշխատել է լրիվ սկանավորման ռեժիմով և միացվել է ddMS2 մոնիթորինգի ռեժիմին՝ մեծ ծավալի տվյալներ հավաքելու համար: MS պարամետրերը սահմանվել են հետևյալ կերպ՝ ցողման լարում +3.8 կՎ/- 3.2 կՎ, մազանոթային ջերմաստիճան 320°C, պաշտպանիչ գազ 40 արբ, օժանդակ գազ 10 արբ, զոնդի տաքացուցիչի ջերմաստիճան 350°C, սկանավորման միջակայք 70–1050 մ/ժ, լուծաչափ 70 000: Տվյալները ստացվել են Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) օգտագործմամբ:
Տվյալների որակը գնահատելու համար, որակի համախմբված վերահսկողության (ՈՀ) նմուշներ են ստացվել՝ յուրաքանչյուր նմուշից 10 մկլ ալիքվոտ ալիքվոտ հեռացնելով վերին շերտից: Վերլուծական հաջորդականության սկզբում վերլուծվել է որակի վերահսկողության վեց նմուշի ներարկում՝ UPLC-MS համակարգի կայունությունը գնահատելու համար: Այնուհետև որակի վերահսկողության նմուշները պարբերաբար ներմուծվում են խմբաքանակ: Այս ուսումնասիրության մեջ շիճուկի նմուշների բոլոր 11 խմբաքանակները վերլուծվել են LC-MS-ով: 100 առողջ դոնորներից վերցված շիճուկի համախմբի խառնուրդի ալիքվոտները օգտագործվել են որպես համապատասխան խմբաքանակներում հղման նյութ՝ արդյունահանման գործընթացը վերահսկելու և խմբաքանակից խմբաքանակ ազդեցությունները ճշգրտելու համար: Հայտնաբերման կոհորտի, ներքին վավերացման կոհորտի և արտաքին վավերացման կոհորտի ոչ նպատակային մետաբոլոմիկական վերլուծությունը կատարվել է Սուն Յաթ-սենի համալսարանի մետաբոլոմիկայի կենտրոնում: Գուանդունի տեխնոլոգիական համալսարանի վերլուծության և թեստավորման կենտրոնի արտաքին լաբորատորիան նույնպես վերլուծել է արտաքին կոհորտից վերցված 40 նմուշ՝ դասակարգչի մոդելի աշխատանքը ստուգելու համար:
Էքստրակցիայից և վերականգնումից հետո, շիճուկային մետաբոլիտների բացարձակ քանակական որոշումը չափվել է գերբարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (Agilent 6495 եռակի քառաբևեռ) միջոցով՝ էլեկտրոցողման իոնացման (ESI) աղբյուրով, բազմակի ռեակցիայի մոնիթորինգի (MRM) ռեժիմով: Մետաբոլիտները առանձնացնելու համար օգտագործվել է ACQUITY BEH ամիդային սյուն (2.1 × 100 մմ, 1.7 մկմ, Waters): Շարժական փուլը բաղկացած էր 90% (A) և 5% ացետոնիտրիլից (B)՝ 10 մմոլ/լ ամոնիումի ացետատով և 0.1% ամոնիակի լուծույթով: Գրադիենտային ծրագիրը հետևյալն էր՝ 0–1.5 րոպե, 0% B; 1.5–6.5 րոպե, 0–15% B; 6.5–8 րոպե, 15% B; 8–8.5 րոպե, 15%–0% B; 8.5–11.5 րոպե, 0% B: Ավտոնմուշառիչում սյունը պահպանվել է 40°C, իսկ նմուշը՝ 10°C ջերմաստիճանում: Հոսքի արագությունը կազմել է 0.3 մլ/րոպե, իսկ ներարկման ծավալը՝ 1 մկլ: MS պարամետրերը սահմանվել են հետևյալ կերպ՝ մազանոթային լարում ±3.5 կՎ, նեբուլայզերի ճնշում 35 psi, թաղանթային գազի հոսք 12 լ/րոպե, թաղանթային գազի ջերմաստիճան 350°C, չորացման գազի ջերմաստիճան 250°C և չորացման գազի հոսք 14 լ/րոպե: Տրիպտոֆանի, պիրուվատի, լակտատի, հիպոքսանտինի և քսանտինի MRM փոխակերպումները համապատասխանաբար կազմել են 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 և 151.0–107.9: Տվյալները հավաքագրվել են Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) ծրագրի միջոցով: Արյան շիճուկի նմուշների համար տրիպտոֆանը, պիրուվատը, լակտատը, հիպոքսանտինը և քսանտինը քանակապես որոշվել են ստանդարտ խառնուրդի լուծույթների տրամաչափման կորերի միջոցով: Բջջային նմուշների համար տրիպտոֆանի պարունակությունը նորմալացվել է ներքին ստանդարտի և բջջային սպիտակուցի զանգվածի նկատմամբ:
Պիկերի արդյունահանումը (մ/զ և պահպանման ժամանակ (RT)) իրականացվել է Compound Discovery 3.1 և TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) ծրագրաշարերի միջոցով: Խմբաքանակների միջև հնարավոր տարբերությունները վերացնելու համար փորձարկվող նմուշի յուրաքանչյուր բնորոշ գագաթ բաժանվել է նույն խմբաքանակի հղման նյութի բնորոշ գագաթին՝ հարաբերական առատությունը ստանալու համար: Ներքին ստանդարտների հարաբերական ստանդարտ շեղումները ստանդարտացումից առաջ և հետո ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ 6-ում: Երկու խմբերի միջև տարբերությունները բնութագրվել են կեղծ հայտնաբերման մակարդակով (FDR<0.05, Wilcoxon-ի նշանային կարգի թեստ) և ծալքի փոփոխությամբ (>1.2 կամ <0.83): Արդյունահանված հատկանիշների հում MS տվյալները և հղման շիճուկով շտկված MS տվյալները ներկայացված են համապատասխանաբար լրացուցիչ տվյալներ 1-ում և լրացուցիչ տվյալներ 2-ում: Պիկերի նշումը կատարվել է նույնականացման չորս սահմանված մակարդակների հիման վրա, ներառյալ նույնականացված մետաբոլիտները, ենթադրաբար մեկնաբանված միացությունները, ենթադրաբար բնութագրված միացությունների դասերը և անհայտ միացությունները 22: Հիմնվելով Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) տվյալների բազայի որոնումների վրա, MS/MS համապատասխանող վավերացված ստանդարտներով կամ mzCloud-ում ճշգրիտ համապատասխանության ծանոթագրություններով (միավոր > 85) կամ Chemspider-ում կենսաբանական միացությունները վերջնականապես ընտրվել են որպես դիֆերենցիալ մետաբոլոմի միջև միջանկյալներ: Յուրաքանչյուր հատկանիշի գագաթնակետային ծանոթագրությունները ներառված են Լրացուցիչ Տվյալներ 3-ում: MetaboAnalyst 5.0-ը օգտագործվել է գումարային նորմալացված մետաբոլիտների առատության միատարր վերլուծության համար: MetaboAnalyst 5.0-ը նաև գնահատել է KEGG ուղու հարստացման վերլուծությունը՝ հիմնվելով զգալիորեն տարբեր մետաբոլիտների վրա: Գլխավոր բաղադրիչների վերլուծությունը (PCA) և մասնակի նվազագույն քառակուսիների տարբերակիչ վերլուծությունը (PLS-DA) վերլուծվել են ropls ծրագրային փաթեթի (v.1.26.4) միջոցով՝ կուտակման նորմալացմամբ և ավտոմատ մասշտաբավորմամբ: Հանգույցների չարորակությունը կանխատեսելու համար օպտիմալ մետաբոլիտների բիոմարկերի մոդելը ստեղծվել է նվազագույն բացարձակ կծկումով և ընտրության օպերատորով երկուական լոգիստիկ ռեգրեսիայի միջոցով (LASSO, R փաթեթ v.4.1-3): Դիսկրիմինանտ մոդելի աշխատանքը հայտնաբերման և վավերացման հավաքածուներում բնութագրվել է AUC-ի գնահատմամբ՝ հիմնվելով ROC վերլուծության վրա՝ համաձայն pROC փաթեթի (v.1.18.0.): Օպտիմալ հավանականության սահմանային արժեքը ստացվել է մոդելի առավելագույն Յուդենի ինդեքսի հիման վրա (զգայունություն + յուրահատկություն – 1): Շեմից փոքր կամ մեծ արժեքներ ունեցող նմուշները համապատասխանաբար կկանխատեսվեն որպես բարորակ հանգույցներ և թոքերի ադենոկարցինոմա:
A549 բջիջները (#CCL-185, American Type Culture Collection) աճեցվել են 10% FBS պարունակող F-12K միջավայրում: SLC7A5-ին և ոչ թիրախային վերահսկիչին (NC) ուղղված կարճ մազակալման ՌՆԹ-ի (shRNA) հաջորդականությունները տեղադրվել են լենտիվիրուսային pLKO.1-puro վեկտորի մեջ: ShSLC7A5-ի հակասենս հաջորդականությունները հետևյալն են՝ Sh1 (5′-GGAGAAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′): SLC7A5-ի (#5347) և տուբուլինի (#2148) հակամարմինները ձեռք են բերվել Cell Signaling Technology-ից: SLC7A5-ի և տուբուլինի հակամարմինները օգտագործվել են 1:1000 նոսրացմամբ՝ Western blot վերլուծության համար:
Seahorse XF գլիկոլիտիկ սթրես թեստը չափում է արտաբջջային թթվայնացման (ECAR) մակարդակը: Փորձարկման ընթացքում գլյուկոզա, օլիգոմիցին A և 2-DG հաջորդաբար ներարկվել են՝ ECAR-ի միջոցով չափված բջջային գլիկոլիտիկ կարողությունը ստուգելու համար:
Ոչ թիրախային վերահսկիչով (NC) և shSLC7A5 (Sh1, Sh2) տրանսֆեկտված A549 բջիջները գիշերը տեղադրվել են 10 սմ տրամագծով ամանների մեջ: Բջջային մետաբոլիտները արդյունահանվել են 1 մլ սառցե 80% ջրային մեթանոլով: Մեթանոլի լուծույթի մեջ գտնվող բջիջները քերվել են, հավաքվել նոր խողովակի մեջ և ցենտրիֆուգացվել 15,000 × g-ով 15 րոպե 4°C ջերմաստիճանում: Հավաքել 800 մկլ վերին շերտ և չորացնել բարձր արագությամբ վակուումային կոնցենտրատորով: Այնուհետև չորացրած մետաբոլիտների գնդիկները վերլուծվել են տրիպտոֆանի մակարդակի համար՝ օգտագործելով LC-MS/MS, ինչպես նկարագրված է վերևում: A549 բջիջներում (NC և shSLC7A5) բջջային NAD(H) մակարդակները չափվել են քանակական NAD+/NADH գունաչափական հավաքածուի (#K337, BioVision) միջոցով՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների: Սպիտակուցների մակարդակը չափվել է յուրաքանչյուր նմուշի համար՝ մետաբոլիտների քանակը նորմալացնելու համար:
Նմուշի չափը նախնական որոշելու համար վիճակագրական մեթոդներ չեն օգտագործվել: Կենսանշանների հայտնաբերմանն ուղղված նախորդ մետաբոլոմիկական ուսումնասիրությունները15,18 համարվել են չափի որոշման չափանիշ, և այս զեկույցների համեմատ մեր նմուշը բավարար էր: Ուսումնասիրության խմբից ոչ մի նմուշ չի բացառվել: Արյան շիճուկի նմուշները պատահականորեն բաշխվել են հայտնաբերման խմբի (306 դեպք, 74.6%) և ներքին վավերացման խմբի (104 դեպք, 25.4%)՝ ոչ թիրախային մետաբոլոմիկական ուսումնասիրությունների համար: Մենք նաև պատահականորեն ընտրել ենք 70 դեպք յուրաքանչյուր խմբից՝ թիրախային մետաբոլոմիկական ուսումնասիրությունների հայտնաբերումների հավաքածուից: Հետազոտողները կույր էին խմբային բաշխման հարցում՝ LC-MS տվյալների հավաքագրման և վերլուծության ընթացքում: Մետաբոլոմիկական տվյալների և բջջային փորձերի վիճակագրական վերլուծությունները նկարագրված են համապատասխան «Արդյունքներ», «Նկարների լեգենդներ» և «Մեթոդներ» բաժիններում: Բջջային տրիպտոֆանի, NADT-ի և գլիկոլիտիկ ակտիվության քանակականացումը կատարվել է երեք անգամ անկախ՝ նույնական արդյունքներով:
Ուսումնասիրության դիզայնի վերաբերյալ լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս այս հոդվածին կից «Բնական պորտֆոլիոյի հաշվետվության ամփոփագիրը»։
Արդյունահանված հատկանիշների հում MS տվյալները և հղման շիճուկի նորմալացված MS տվյալները ներկայացված են համապատասխանաբար Լրացուցիչ տվյալներ 1-ում և Լրացուցիչ տվյալներ 2-ում: Դիֆերենցիալ հատկանիշների գագաթնակետային նշումները ներկայացված են Լրացուցիչ տվյալներ 3-ում: LUAD TCGA տվյալների հավաքածուն կարելի է ներբեռնել https://portal.gdc.cancer.gov/ կայքից: Գրաֆիկը գծագրելու համար մուտքային տվյալները տրամադրված են աղբյուրային տվյալներում: Աղբյուրի տվյալները տրամադրված են այս հոդվածի համար:
Թոքերի ազգային սկրինինգի ուսումնասիրության խումբ և այլն: Թոքերի քաղցկեղից մահացության նվազեցում ցածր դեղաչափով համակարգչային տոմոգրաֆիայի միջոցով: Հյուսիսային Անգլիա: J. Med. 365, 395–409 (2011):
Կրամեր, Բ.Ս., Բերգ, Կ.Դ., Աբերլե, Դ.Ռ. և Փրոֆեթ, Պ.Ս. Թոքերի քաղցկեղի սկրինինգ՝ օգտագործելով ցածր դեղաչափով պարուրաձև համակարգչային տոմոգրաֆիա. Թոքերի ազգային սկրինինգային ուսումնասիրության (NLST) արդյունքները: J. Med. Screen 18, 109–111 (2011):
Դե Կոնինգ, Հ.Ջ. և այլք։ Թոքերի քաղցկեղից մահացության նվազեցում ծավալային համակարգչային շերտագրության միջոցով՝ պատահականացված փորձարկման ժամանակ։ Հյուսիսային Անգլիա։ J. Med. 382, ​​503–513 (2020)։