Մետաբոլոմիկա, որը տարբերում է բարորակ և չարորակ թոքային հանգույցները բարձր սպեցիֆիկությամբ՝ օգտագործելով հիվանդի շիճուկի զանգվածային սպեկտրաչափական վերլուծությունը:

Համակարգչային տոմոգրաֆիայի (CT) միջոցով հայտնաբերված թոքային հանգույցների դիֆերենցիալ ախտորոշումը մնում է մարտահրավեր կլինիկական պրակտիկայում:Այստեղ մենք բնութագրում ենք 480 շիճուկի նմուշների գլոբալ նյութափոխանակությունը, ներառյալ առողջ հսկիչները, թոքերի բարորակ հանգույցները և թոքերի ադենոկարցինոման I փուլը:Ադենոկարցինոման ցուցադրում է յուրահատուկ նյութափոխանակության պրոֆիլներ, մինչդեռ բարորակ հանգույցները և առողջ անհատները մեծ նմանություն ունեն նյութափոխանակության պրոֆիլներում:Հայտնաբերման խմբում (n = 306) հայտնաբերվել է 27 մետաբոլիտների մի շարք՝ բարորակ և չարորակ հանգույցները տարբերելու համար:Խտրական մոդելի AUC-ն ներքին վավերացման (n = 104) և արտաքին վավերացման (n = 111) խմբերում համապատասխանաբար եղել է 0,915 և 0,945:Ճանապարհի վերլուծությունը բացահայտեց գլիկոլիտիկ մետաբոլիտների ավելացում՝ կապված թոքերի ադենոկարցինոմայի շիճուկում տրիպտոֆանի նվազման հետ՝ համեմատած բարորակ հանգույցների և առողջ հսկիչների հետ, և առաջարկեց, որ տրիպտոֆանի կլանումը խթանում է գլիկոլիզը թոքերի քաղցկեղի բջիջներում:Մեր ուսումնասիրությունը ընդգծում է շիճուկի մետաբոլիտի կենսամարկերների արժեքը՝ CT-ով հայտնաբերված թոքային հանգույցների ռիսկը գնահատելու համար:
Վաղ ախտորոշումը չափազանց կարևոր է քաղցկեղով հիվանդների գոյատևման մակարդակը բարելավելու համար:ԱՄՆ-ի թոքերի քաղցկեղի դեմ պայքարի ազգային հետազոտության (NLST) և Եվրոպական NELSON հետազոտության արդյունքները ցույց են տվել, որ ցածր չափաբաժիններով համակարգչային տոմոգրաֆիայի (LDCT) սկրինինգը կարող է զգալիորեն նվազեցնել թոքերի քաղցկեղից մահացությունը բարձր ռիսկային խմբերում1,2,3:Թոքերի քաղցկեղի սկրինինգի համար LDCT-ի լայն տարածումից ի վեր, ասիմպտոմատիկ թոքային հանգույցների պատահական ռադիոգրաֆիկ հայտնաբերումների հաճախականությունը շարունակել է աճել 4 :Թոքային հանգույցները սահմանվում են որպես կիզակետային անթափանցիկություն մինչև 3 սմ տրամագծով 5:Մենք դժվարությունների ենք հանդիպում չարորակ ուռուցքի հավանականությունը գնահատելու և LDCT-ով պատահաբար հայտնաբերված մեծ թվով թոքային հանգույցների հետ գործ ունենալու հարցում:CT-ի սահմանափակումները կարող են հանգեցնել հաճախակի հետագա հետազոտությունների և կեղծ դրական արդյունքների, ինչը հանգեցնում է անհարկի միջամտության և գերբուժման6:Հետևաբար, անհրաժեշտություն կա մշակել հուսալի և օգտակար բիոմարկերներ՝ թոքերի քաղցկեղը վաղ փուլերում ճիշտ բացահայտելու և սկզբնական հայտնաբերման ժամանակ բարորակ հանգույցների մեծ մասը տարբերակելու համար 7:
Արյան համապարփակ մոլեկուլային վերլուծությունը (շիճուկ, պլազմա, ծայրամասային արյան միամիջուկային բջիջներ), ներառյալ գենոմիկան, պրոտեոմիկան կամ ԴՆԹ-ի մեթիլացումը8,9,10, հանգեցրել է թոքերի քաղցկեղի ախտորոշիչ կենսամարկերների հայտնաբերման հետաքրքրության աճին:Միևնույն ժամանակ, մետաբոլոմիկայի մոտեցումները չափում են բջջային վերջնական արտադրանքները, որոնք ազդում են էնդոգեն և էկզոգեն գործողությունների վրա և, հետևաբար, կիրառվում են հիվանդության սկիզբը և արդյունքը կանխատեսելու համար:Հեղուկ քրոմատագրաֆիա-տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիան (LC-MS) լայնորեն կիրառվող մեթոդ է նյութափոխանակության ուսումնասիրությունների համար՝ շնորհիվ իր բարձր զգայունության և մեծ դինամիկ միջակայքի, որը կարող է ծածկել տարբեր ֆիզիկաքիմիական հատկություններով մետաբոլիտներ11,12,13:Թեև պլազմայի/շիճուկի գլոբալ նյութափոխանակության վերլուծությունը օգտագործվել է թոքերի քաղցկեղի ախտորոշման 14,15,16,17 ախտորոշման և բուժման արդյունավետության հետ կապված բիոմարկերների հայտնաբերման համար, 18 շիճուկ մետաբոլիտների դասակարգիչներ՝ թոքերի բարորակ և չարորակ հանգույցները տարբերելու համար դեռ պետք է շատ ուսումնասիրվեն:- զանգվածային հետազոտություն.
Ադենոկարցինոման և տափակ բջջային քաղցկեղը թոքերի ոչ մանրբջջային քաղցկեղի երկու հիմնական ենթատեսակներն են (NSCLC):Տարբեր CT սքրինինգ թեստեր ցույց են տալիս, որ ադենոկարցինոման թոքերի քաղցկեղի ամենատարածված հիստոլոգիական տեսակն է1,19,20,21:Այս ուսումնասիրության մեջ մենք օգտագործեցինք գերարդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-բարձր լուծաչափի զանգվածային սպեկտրոմետրիա (UPLC-HRMS)՝ 695 շիճուկի ընդհանուր նմուշների վրա նյութափոխանակության վերլուծություն կատարելու համար, ներառյալ առողջ հսկիչները, բարորակ թոքային հանգույցները և CT-ով հայտնաբերված ≤3 սմ:Թոքերի ադենոկարցինոմայի I փուլի սքրինինգ:Մենք հայտնաբերեցինք շիճուկի մետաբոլիտների մի խումբ, որը տարբերում է թոքերի ադենոկարցինոման բարորակ հանգույցներից և առողջ հսկիչներից:Ճանապարհի հարստացման վերլուծությունը ցույց է տվել, որ տրիպտոֆանի և գլյուկոզայի աննորմալ նյութափոխանակությունը սովորական փոփոխություններ են թոքերի ադենոկարկինոմայում՝ համեմատած բարորակ հանգույցների և առողջ հսկողության հետ:Վերջապես, մենք ստեղծեցինք և վավերացրինք շիճուկի նյութափոխանակության դասակարգիչը՝ բարձր սպեցիֆիկությամբ և զգայունությամբ՝ տարբերելու LDCT-ով հայտնաբերված չարորակ և բարորակ թոքային հանգույցները, ինչը կարող է օգնել վաղ դիֆերենցիալ ախտորոշմանը և ռիսկի գնահատմանը:
Ընթացիկ հետազոտության ընթացքում սեռին և տարիքին համապատասխանող շիճուկի նմուշները հետահայաց կերպով հավաքվել են 174 առողջ հսկիչներից, 292 հիվանդից՝ բարորակ թոքային հանգույցներով և 229 հիվանդներից՝ I աստիճանի թոքերի ադենոկարցինոմայով:695 առարկաների ժողովրդագրական բնութագրերը ներկայացված են Լրացուցիչ Աղյուսակ 1-ում:
Ինչպես ցույց է տրված Նկար 1ա-ում, ընդհանուր առմամբ 480 շիճուկ նմուշներ, ներառյալ 174 առողջ հսկողություն (HC), 170 բարորակ հանգույցներ (BN) և 136 փուլի թոքերի ադենոկարկինոմայի (LA) նմուշներ, հավաքվել են Սուն Յաթ-սեն համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնում:Բացահայտման խումբ անուղղակի նյութափոխանակության պրոֆիլավորման համար՝ օգտագործելով գերարդյունավետ հեղուկ քրոմատագրություն՝ բարձր լուծաչափի զանգվածային սպեկտրոմետրիա (UPLC-HRMS):Ինչպես ցույց է տրված Լրացուցիչ Նկար 1-ում, LA-ի և HC-ի, LA-ի և BN-ի դիֆերենցիալ մետաբոլիտները հայտնաբերվել են դասակարգման մոդել ստեղծելու և դիֆերենցիալ ուղիների վերլուծության հետագա ուսումնասիրման համար:Սուն Յաթ-սեն համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնի կողմից հավաքված 104 նմուշ և երկու այլ հիվանդանոցների կողմից հավաքված 111 նմուշներ ենթարկվել են համապատասխանաբար ներքին և արտաքին վավերացման:
հայտնաբերման կոհորտայի հետազոտական ​​պոպուլյացիա, որն անցել է շիճուկի գլոբալ նյութափոխանակության վերլուծություն՝ օգտագործելով գերարդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆիա՝ բարձր լուծաչափության զանգվածային սպեկտրոմետրիա (UPLC-HRMS):բ հետազոտվող խմբի 480 շիճուկի նմուշների ընդհանուր մետաբոլոմի մասնակի նվազագույն քառակուսի դիսկրիմինանտ վերլուծություն (PLS-DA), ներառյալ առողջ վերահսկիչները (HC, n = 174), բարորակ հանգույցները (BN, n = 170) և I փուլի թոքերի ադենոկարցինոման: (Լոս Անջելես, n = 136):+ESI, դրական էլեկտրասփրեյ իոնացման ռեժիմ, -ESI, բացասական էլեկտրասփրեյ իոնացման ռեժիմ։c–e էականորեն տարբեր առատությամբ մետաբոլիտները երկու տրված խմբերում (երկկողմանի Wilcoxon-ի նշանային աստիճանի թեստ, կեղծ հայտնաբերման արագության ճշգրտված p արժեք, FDR <0,05) ցուցադրվում են կարմիր (ծալովի փոփոխություն > 1,2) և կապույտ (ծալովի փոփոխություն < 0,83) .) ցուցադրված է հրաբխի գրաֆիկի վրա:f Հիերարխիկ կլաստերավորման ջերմային քարտեզ, որը ցույց է տալիս զգալի տարբերություններ LA-ի և BN-ի միջև ծանոթագրված մետաբոլիտների քանակի մեջ:Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են աղբյուրի տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Հայտնաբերված խմբում 174 HC, 170 BN և 136 LA շիճուկի ընդհանուր մետաբոլոմը վերլուծվել է UPLC-HRMS վերլուծության միջոցով:Մենք նախ ցույց ենք տալիս, որ որակի վերահսկման (QC) նմուշները սերտորեն հավաքվում են չվերահսկվող հիմնական բաղադրիչի վերլուծության (PCA) մոդելի կենտրոնում՝ հաստատելով ընթացիկ հետազոտության կատարողականի կայունությունը (Լրացուցիչ նկար 2):
Ինչպես ցույց է տրված Նկար 1 բ-ի նվազագույն քառակուսիների տարբերակիչ վերլուծության մեջ (PLS-DA), մենք պարզեցինք, որ հստակ տարբերություններ կան LA-ի և BN-ի, LA-ի և HC-ի միջև դրական (+ESI) և բացասական (−ESI) էլեկտրասփրեյ իոնացման ռեժիմներում: .մեկուսացված.Այնուամենայնիվ, +ESI և -ESI պայմաններում BN-ի և HC-ի միջև էական տարբերություններ չեն հայտնաբերվել:
Մենք գտանք 382 դիֆերենցիալ հատկանիշ LA-ի և HC-ի միջև, 231 դիֆերենցիալ հատկանիշ LA-ի և BN-ի միջև և 95 դիֆերենցիալ առանձնահատկություններ BN-ի և HC-ի միջև (Wilcoxon-ի ստորագրված վարկանիշային թեստ, FDR <0.05 և բազմակի փոփոխություն >1.2 կամ <0.83) (Նկար .1c-e): ).Գագաթները հետագայում նշվել են (Լրացուցիչ տվյալներ 3) տվյալների բազայի նկատմամբ (mzCloud/HMDB/Chemspider գրադարան) ըստ m/z արժեքի, պահպանման ժամանակի և զանգվածային սպեկտրի մասնատման որոնման (մանրամասները նկարագրված են Մեթոդներ բաժնում) 22:Ի վերջո, 33 և 38 ծանոթագրված մետաբոլիտներ, որոնց առատության մեջ զգալի տարբերություններ կան, LA-ն ընդդեմ BN-ի (Նկար 1f և Լրացուցիչ Աղյուսակ 2) և LA-ն ընդդեմ HC-ի (Լրացուցիչ Նկար 3 և Լրացուցիչ Աղյուսակ 2), համապատասխանաբար, հայտնաբերվել են:Ի հակադրություն, BN-ում և HC-ում հայտնաբերվել են միայն 3 մետաբոլիտներ, որոնց առատության էական տարբերությունները (Լրացուցիչ Աղյուսակ 2), որոնք համապատասխանում են PLS-DA-ում BN-ի և HC-ի միջև համընկնմանը:Այս դիֆերենցիալ մետաբոլիտները ներառում են կենսաքիմիական նյութերի լայն շրջանակ (Լրացուցիչ նկար 4):Միասին այս արդյունքները ցույց են տալիս շիճուկի նյութափոխանակության զգալի փոփոխություններ, որոնք արտացոլում են թոքերի քաղցկեղի վաղ փուլի չարորակ փոխակերպումները՝ համեմատած թոքերի բարորակ հանգույցների կամ առողջ առարկաների հետ:Միևնույն ժամանակ, BN-ի և HC-ի շիճուկի մետաբոլոմի նմանությունը ցույց է տալիս, որ բարորակ թոքային հանգույցները կարող են կիսել բազմաթիվ կենսաբանական բնութագրեր առողջ անհատների հետ:Հաշվի առնելով, որ էպիդերմիսի աճի գործոնի ընկալիչի (EGFR) գենային մուտացիաները տարածված են թոքերի ադենոկարցինոմայի 23 ենթատեսակում, մենք ձգտեցինք որոշել վարորդական մուտացիաների ազդեցությունը շիճուկի նյութափոխանակության վրա:Այնուհետև մենք վերլուծեցինք թոքերի ադենոկարցինոմայի խմբում EGFR կարգավիճակով 72 դեպքերի ընդհանուր նյութափոխանակության պրոֆիլը:Հետաքրքիր է, որ մենք գտանք համեմատելի պրոֆիլներ EGFR մուտանտով հիվանդների (n = 41) և EGFR վայրի տիպի հիվանդների (n = 31) միջև PCA վերլուծության մեջ (Լրացուցիչ նկար 5ա):Այնուամենայնիվ, մենք հայտնաբերել ենք 7 մետաբոլիտ, որոնց առատությունը զգալիորեն փոխվել է EGFR մուտացիայով հիվանդների մոտ՝ համեմատած վայրի տիպի EGFR-ով հիվանդների հետ (t թեստ, p <0,05 և ծալովի փոփոխություն > 1,2 կամ < 0,83) (Լրացուցիչ նկար 5b):Այս մետաբոլիտների մեծ մասը (7-ից 5-ը) ացիլկարնիտիններ են, որոնք կարևոր դեր են խաղում ճարպաթթուների օքսիդացման ուղիներում:
Ինչպես ցույց է տրված Նկար 2 ա-ում ներկայացված աշխատանքային հոսքում, հանգույցների դասակարգման համար բիոմարկերները ստացվել են՝ օգտագործելով նվազագույն բացարձակ նեղացման օպերատորները և ընտրությունը՝ հիմնված LA (n = 136) և BN (n = 170) 33 դիֆերենցիալ մետաբոլիտների վրա:Փոփոխականների լավագույն համադրություն (LASSO) – երկուական լոգիստիկ ռեգրեսիոն մոդել:Մոդելի հուսալիությունը ստուգելու համար օգտագործվել է տասնապատիկ խաչաձև վավերացում:Փոփոխական ընտրությունը և պարամետրերի կանոնավորացումը ճշգրտվում են λ24 պարամետրով հավանականության մաքսիմալացման տույժով:Համաշխարհային նյութափոխանակության վերլուծությունը հետագայում իրականացվել է անկախ ներքին վավերացման (n = 104) և արտաքին վավերացման (n = 111) խմբերում՝ տարբերակիչ մոդելի դասակարգման կատարողականությունը ստուգելու համար:Արդյունքում, հայտնաբերման հավաքածուի 27 մետաբոլիտները ճանաչվեցին որպես լավագույն տարբերակիչ մոդել՝ ամենամեծ միջին AUC արժեքով (նկ. 2բ), որոնցից 9-ը LA-ում ավելացել էին ակտիվություն, իսկ 18-ը՝ իջած ակտիվություն LA-ում՝ համեմատած BN-ի հետ (նկ. 2գ):
Թոքային հանգույցների դասակարգիչ կառուցելու համար աշխատանքային հոսք, ներառյալ հայտնաբերման հավաքածուում շիճուկի մետաբոլիտների լավագույն վահանակի ընտրությունը, օգտագործելով երկուական լոգիստիկ ռեգրեսիոն մոդելը տասնապատիկ խաչաձև վավերացման և ներքին և արտաքին վավերացման հավաքածուներում կանխատեսող կատարողականի գնահատման միջոցով:b LASSO ռեգրեսիոն մոդելի խաչաձև վավերացման վիճակագրություն՝ նյութափոխանակության կենսամարկերների ընտրության համար:Վերոնշյալ թվերը ներկայացնում են տվյալ λ-ում ընտրված կենսամարկերների միջին թիվը:Կարմիր կետավոր գիծը ներկայացնում է միջին AUC արժեքը համապատասխան լամբդայում:Մոխրագույն սխալի գծերը ներկայացնում են նվազագույն և առավելագույն AUC արժեքները:Կետավոր գիծը ցույց է տալիս լավագույն մոդելը՝ ընտրված 27 բիոմարկերներով:AUC, ընդունիչի գործառնական բնութագրերի (ROC) կորի տակ գտնվող տարածք:գ LA խմբում 27 ընտրված մետաբոլիտների փոփոխությունները ծալովի են՝ համեմատած հայտնաբերված խմբի BN խմբի հետ:Կարմիր սյունակ - ակտիվացում:Կապույտ սյունակը անկում է:d–f Ընդունիչի գործառնական բնութագրերի (ROC) կորեր, որոնք ցույց են տալիս տարբերակիչ մոդելի հզորությունը՝ հիմնված 27 մետաբոլիտների համակցությունների վրա հայտնաբերման, ներքին և արտաքին վավերացման հավաքածուներում:Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են աղբյուրի տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Այս 27 մետաբոլիտների կշռված ռեգրեսիայի գործակիցների հիման վրա ստեղծվել է կանխատեսման մոդել (Լրացուցիչ Աղյուսակ 3):Այս 27 մետաբոլիտների վրա հիմնված ROC վերլուծությունը հանգեցրեց կորի (AUC) արժեքի տարածքի 0,933 արժեքի տակ, հայտնաբերման խմբի զգայունությունը 0,868 էր, իսկ սպեցիֆիկությունը՝ 0,859 (նկ. 2d):Միևնույն ժամանակ, LA-ի և HC-ի միջև 38 ծանոթագրված դիֆերենցիալ մետաբոլիտների շարքում 16 մետաբոլիտների հավաքածուն հասել է AUC-ի 0,902-ի՝ 0,801 զգայունությամբ և 0,856-ի յուրահատկությամբ՝ LA-ն HC-ից տարբերելու համար (Լրացուցիչ նկար 6a-c):Համեմատվել են նաև AUC արժեքները՝ հիմնված դիֆերենցիալ մետաբոլիտների տարբեր ծալովի փոփոխության շեմերի վրա:Մենք գտանք, որ դասակարգման մոդելը լավագույնս հանդես է եկել LA-ի և BN-ի (HC) միջև տարբերակելու հարցում, երբ ծալովի փոփոխության մակարդակը սահմանվել է 1.2-ի դիմաց 1.5-ի կամ 2.0-ի (Լրացուցիչ նկար 7a,b):Դասակարգման մոդելը, որը հիմնված է 27 մետաբոլիտ խմբերի վրա, հետագայում հաստատվել է ներքին և արտաքին խմբերում:AUC-ն եղել է 0,915 (զգայունությունը 0,867, սպեցիֆիկությունը 0,811) ներքին վավերացման համար և 0,945 (զգայունությունը 0,810, սպեցիֆիկությունը 0,979) արտաքին վավերացման համար (նկ. 2e, f):Միջլաբորատոր արդյունավետությունը գնահատելու համար արտաքին կոհորտից 40 նմուշ վերլուծվել է արտաքին լաբորատորիայում, ինչպես նկարագրված է «Մեթոդներ» բաժնում:Դասակարգման ճշգրտությունը հասել է 0,925 AUC-ի (Լրացուցիչ նկար 8):Քանի որ թոքերի տափակ բջջային քաղցկեղը (LUSC) թոքերի ոչ մանրբջջային թոքերի քաղցկեղի (NSCLC) երկրորդ ամենատարածված ենթատեսակն է թոքերի ադենոկարցինոմայից (LUAD) հետո, մենք նաև փորձարկել ենք նյութափոխանակության պրոֆիլների վավերացված պոտենցիալ օգտակարությունը:BN և LUSC-ի 16 դեպք:LUSC-ի և BN-ի միջև խտրականության AUC-ն եղել է 0,776 (Լրացուցիչ նկար 9), ինչը ցույց է տալիս ավելի վատ կարողություն՝ համեմատած LUAD-ի և BN-ի միջև խտրականության հետ:
Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ CT պատկերների վրա հանգույցների չափը դրականորեն փոխկապակցված է չարորակ ուռուցքի հավանականության հետ և մնում է հանգույցների բուժման հիմնական որոշիչը25,26,27:NELSON-ի սքրինինգային հետազոտության մեծ խմբի տվյալների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ <5 մմ հանգույցներով առարկաների չարորակ ուռուցքի ռիսկը նույնիսկ նման է առանց հանգույցների առարկաների 28:Հետևաբար, կանոնավոր CT մոնիտորինգ պահանջող նվազագույն չափը 5 մմ է, ինչպես առաջարկվում է Բրիտանական կրծքավանդակի միության (BTS) կողմից, և 6 մմ, ինչպես առաջարկվում է Fleischner Society-ի կողմից 29:Այնուամենայնիվ, 6 մմ-ից մեծ և առանց ակնհայտ բարորակ հատկանիշների հանգույցները, որոնք կոչվում են անորոշ թոքային հանգույցներ (IPN), մնում են կլինիկական պրակտիկայում գնահատման և կառավարման հիմնական մարտահրավերը30,31:Մենք հաջորդիվ ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք հանգույցի չափը ազդել է նյութափոխանակության ստորագրությունների վրա՝ օգտագործելով հայտնաբերման և ներքին վավերացման խմբերի համախմբված նմուշները:Կենտրոնանալով 27 վավերացված կենսամարկերների վրա՝ մենք նախ համեմատեցինք HC և BN ենթ 6 մմ մետաբոլոմների PCA պրոֆիլները:Մենք գտանք, որ HC-ի և BN-ի տվյալների կետերի մեծ մասը համընկնում են՝ ցույց տալով, որ շիճուկի մետաբոլիտի մակարդակները նույնն են երկու խմբերում (նկ. 3ա):Տարբեր չափերի տիրույթների առանձնահատկությունների քարտեզները պահպանվել են BN-ում և LA-ում (նկ. 3b, c), մինչդեռ 6-20 մմ միջակայքում նկատվել է տարանջատում չարորակ և բարորակ հանգույցների միջև (նկ. 3d):Այս խումբն ուներ AUC 0,927, սպեցիֆիկությունը՝ 0,868 և զգայունությունը՝ 0,820՝ 6-ից 20 մմ չափերով հանգույցների չարորակությունը կանխատեսելու համար (նկ. 3e, f):Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ դասակարգիչը կարող է ֆիքսել մետաբոլիկ փոփոխությունները, որոնք առաջացել են վաղ չարորակ փոխակերպմամբ՝ անկախ հանգույցների չափից:
PCA պրոֆիլների համեմատություն նշված խմբերի միջև՝ հիմնված 27 մետաբոլիտների նյութափոխանակության դասակարգչի վրա:CC և BN < 6 մմ:b BN < 6 մմ vs BN 6–20 մմ:LA-ում 6–20 մմ ընդդեմ LA 20–30 մմ:g BN 6–20 մմ և LA 6–20 մմ:GC, n = 174;BN < 6 մմ, n = 153;BN 6–20 մմ, n = 91;LA 6–20 մմ, n = 89;LA 20–30 մմ, n = 77. e Ընդունիչի գործառնական բնութագրի (ROC) կորը, որը ցույց է տալիս տարբերակիչ մոդելի կատարումը 6–20 մմ հանգույցների համար:f Հավանականության արժեքները հաշվարկվել են 6-20 մմ չափերով հանգույցների լոգիստիկ ռեգրեսիայի մոդելի հիման վրա:Մոխրագույն կետավոր գիծը ներկայացնում է օպտիմալ անջատման արժեքը (0,455):Վերոնշյալ թվերը ներկայացնում են Լոս Անջելեսի համար նախատեսված դեպքերի տոկոսը:Օգտագործեք երկու պոչ ուսանողի t թեստ:PCA, հիմնական բաղադրիչի վերլուծություն:AUC տարածքը կորի տակ:Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են աղբյուրի տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Չորս նմուշ (44-61 տարեկան) թոքային հանգույցների նման չափերով (7-9 մմ) հետագայում ընտրվել են՝ ցույց տալու համար առաջարկվող չարորակ ուռուցքի կանխատեսման մոդելի կատարումը (նկ. 4ա, բ):Սկզբնական սկրինինգի ժամանակ 1-ին դեպքը ներկայացվել է որպես պինդ հանգույց՝ կալցիֆիկացմամբ, հատկանիշ՝ կապված բարորակության հետ, մինչդեռ 2-րդ դեպքը ներկայացվել է որպես անորոշ մասամբ պինդ հանգույց՝ առանց ակնհայտ բարորակ հատկանիշների:Հետագա CT սկանավորման երեք փուլերը ցույց են տվել, որ այս դեպքերը կայուն են մնացել 4 տարվա ընթացքում և, հետևաբար, համարվում են բարորակ հանգույցներ (նկ. 4ա):Համեմատած սերիական CT սկանավորումների կլինիկական գնահատման հետ, շիճուկի մետաբոլիտի վերլուծությունը ներկայիս դասակարգիչի մոդելի հետ արագ և ճիշտ բացահայտեց այս բարորակ հանգույցները՝ հիմնված հավանական սահմանափակումների վրա (Աղյուսակ 1):Գծապատկեր 4b-ում 3-րդ դեպքում ցույց է տրված նոդուլ՝ պլևրալ ետ քաշման նշաններով, որն առավել հաճախ կապված է չարորակ ուռուցքի հետ32:4-րդ դեպքը ներկայացվել է որպես անորոշ մասնակի պինդ հանգույց՝ առանց բարորակ պատճառի ապացույցների:Այս բոլոր դեպքերը կանխատեսվել են որպես չարորակ՝ ըստ դասակարգիչի մոդելի (Աղյուսակ 1):Թոքերի ադենոկարցինոմայի գնահատումը ցույց է տրվել հիստոպաթոլոգիական հետազոտությամբ թոքերի հեռացման վիրահատությունից հետո (նկ. 4b):Արտաքին վավերացման հավաքածուի համար նյութափոխանակության դասակարգիչը ճշգրիտ կանխատեսել է 6 մմ-ից մեծ թոքերի անորոշ հանգույցների երկու դեպք (Լրացուցիչ նկար 10):
Բարորակ հանգույցների երկու դեպքերի թոքերի առանցքային պատուհանի CT պատկերներ.1-ին դեպքում, CT սկանավորումը 4 տարի անց ցույց տվեց կայուն պինդ հանգույց՝ 7 մմ չափսով, կալցիֆիկացմամբ աջ ստորին բլթի վրա:2-րդ դեպքում CT սկանավորումը 5 տարի հետո հայտնաբերեց աջ վերին բլթի կայուն, մասամբ պինդ հանգույց՝ 7 մմ տրամագծով:b Թոքերի առանցքային պատուհանի CT պատկերներ և I աստիճանի ադենոկարկինոմայի երկու դեպքերի համապատասխան պաթոլոգիական հետազոտություններ՝ թոքերի մասնահատումից առաջ:3-րդ դեպքը աջ վերին բլթի 8 մմ տրամագծով հանգույց է հայտնաբերել՝ պլեվրալ ռետրակցիայով։4-րդ դեպքը ձախ վերին բլթում հայտնաբերեց մասամբ պինդ աղացած ապակյա հանգույց՝ 9 մմ չափով:Հեմատոքսիլինով և էոզինով (H&E) ներկված թոքային հյուսվածքի (սանդղակի բար = 50 մկմ) ներկում, որը ցույց է տալիս թոքերի ադենոկարցինոմայի ասինար աճի օրինաչափությունը:Սլաքները ցույց են տալիս CT պատկերների վրա հայտնաբերված հանգույցները:H&E պատկերները պաթոլոգի կողմից հետազոտված բազմաթիվ (>3) մանրադիտակային դաշտերի ներկայացուցչական պատկերներ են:
Միասին մեր արդյունքները ցույց են տալիս շիճուկի մետաբոլիտի կենսամարկերների պոտենցիալ արժեքը թոքային հանգույցների դիֆերենցիալ ախտորոշման մեջ, ինչը կարող է դժվարություններ առաջացնել CT ցուցադրումը գնահատելիս:
Հիմնվելով վավերացված դիֆերենցիալ մետաբոլիտների վահանակի վրա՝ մենք ձգտեցինք բացահայտել հիմնական նյութափոխանակության փոփոխությունների կենսաբանական կապերը:MetaboAnalyst-ի կողմից KEGG ճանապարհի հարստացման վերլուծությունը հայտնաբերել է 6 ընդհանուր զգալիորեն փոփոխված ուղիներ երկու տվյալ խմբերի միջև (LA-ն ընդդեմ HC-ի և LA-ի ընդդեմ BN-ի, ճշգրտված p≤ 0,001, ազդեցությունը > 0,01):Այս փոփոխությունները բնութագրվում էին պիրուվատի նյութափոխանակության, տրիպտոֆանի նյութափոխանակության, նիասինի և նիկոտինամիդի նյութափոխանակության, գլիկոլիզով, TCA ցիկլի և պուրինային նյութափոխանակության խանգարումներով (նկ. 5ա):Այնուհետև մենք իրականացրեցինք նպատակային նյութափոխանակություն՝ ստուգելու հիմնական փոփոխությունները՝ օգտագործելով բացարձակ քանակականացում:Ընդհանուր մետաբոլիտների որոշում սովորաբար փոփոխված ուղիներում եռակի քառաբևեռ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով (QQQ)՝ օգտագործելով իսկական մետաբոլիտների ստանդարտները:Մետաբոլոմիկայի ուսումնասիրության թիրախային նմուշի ժողովրդագրական բնութագրերը ներառված են Լրացուցիչ Աղյուսակ 4-ում: Համաձայն մեր գլոբալ մետաբոլոմիկայի արդյունքների, քանակական վերլուծությունը հաստատեց, որ հիպոքսանտինը և քսանտինը, պիրուվատը և լակտատը ավելացել են LA-ում՝ համեմատած BN-ի և HC-ի հետ (նկ. 5b, c, p <0,05):Այնուամենայնիվ, այս մետաբոլիտների մեջ էական տարբերություններ չեն հայտնաբերվել BN-ի և HC-ի միջև:
LA խմբում զգալիորեն տարբեր մետաբոլիտների KEGG ճանապարհի հարստացման վերլուծություն՝ համեմատած BN և HC խմբերի հետ:Օգտագործվել է երկկողմանի գլոբալ թեստ, և p արժեքները ճշգրտվել են Holm-Bonferroni մեթոդի միջոցով (ճշգրտված p ≤ 0,001 և էֆեկտի չափը > 0,01):b–d Ջութակի գծապատկերներ, որոնք ցույց են տալիս հիպոքսանտինի, քսանտինի, լակտատի, պիրուվատի և տրիպտոֆանի մակարդակները շիճուկի HC, BN և LA-ում, որոնք որոշվում են LC-MS/MS-ով (n = 70 յուրաքանչյուր խմբի համար):Սպիտակ և սև կետավոր գծերը ցույց են տալիս համապատասխանաբար միջին և քառորդը:Ջութակի գծապատկեր, որը ցույց է տալիս SLC7A5-ի և QPRT-ի նորմալացված Log2TPM (տառագրերը մեկ միլիոնի համար) mRNA արտահայտությունը թոքերի ադենոկարկինոմայում (n = 513)՝ համեմատած նորմալ թոքերի հյուսվածքի (n = 59) LUAD-TCGA տվյալների բազայում:Սպիտակ վանդակը ներկայացնում է միջքառորդական միջակայքը, հորիզոնական սև գիծը կենտրոնում՝ միջինը, իսկ ուղղահայաց սև գիծը, որը տարածվում է վանդակից, ներկայացնում է 95% վստահության միջակայքը (CI):f SLC7A5-ի և GAPDH արտահայտության Pearson-ի հարաբերակցության սյուժեն թոքերի ադենոկարկինոմայում (n = 513) և նորմալ թոքերի հյուսվածքում (n = 59) TCGA տվյալների բազայում:Մոխրագույն տարածքը ներկայացնում է 95% CI:r, Պիրսոնի հարաբերակցության գործակիցը:g նորմալացված բջջային տրիպտոֆանի մակարդակները A549 բջիջներում, որոնք տրանսֆեկցված են ոչ սպեցիֆիկ shRNA հսկողությամբ (NC) և shSLC7A5 (Sh1, Sh2) որոշված ​​LC-MS/MS-ով:Ներկայացված է յուրաքանչյուր խմբի հինգ կենսաբանական անկախ նմուշների վիճակագրական վերլուծություն:h NADt-ի (ընդհանուր NAD, ներառյալ NAD+ և NADH) բջջային մակարդակները A549 բջիջներում (NC) և SLC7A5 նոկդաունի A549 բջիջներում (Sh1, Sh2):Ներկայացված է յուրաքանչյուր խմբի երեք կենսաբանական անկախ նմուշների վիճակագրական վերլուծություն:i A549 բջիջների գլիկոլիտիկ ակտիվությունը SLC7A5 նոկդաունից առաջ և հետո չափվել է արտաբջջային թթվայնացման արագությամբ (ECAR) (n = 4 կենսաբանորեն անկախ նմուշներ յուրաքանչյուր խմբի համար):2-DG,2-deoxy-D-գլյուկոզա.Երկու պոչ ուսանողի t թեստն օգտագործվել է (b–h):(g–i) սխալի տողերը ներկայացնում են միջինը ± SD, յուրաքանչյուր փորձ կատարվեց երեք անգամ անկախ, և արդյունքները նման էին:Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են աղբյուրի տվյալների ֆայլերի տեսքով:
Հաշվի առնելով տրիպտոֆանի փոփոխված նյութափոխանակության զգալի ազդեցությունը LA խմբում, մենք նաև գնահատեցինք շիճուկ տրիպտոֆանի մակարդակները HC, BN և LA խմբերում՝ օգտագործելով QQQ:Մենք գտանք, որ շիճուկի տրիպտոֆանը LA-ում կրճատվել է համեմատած HC-ի կամ BN-ի հետ (p <0.001, Նկար 5դ), ինչը համահունչ է նախորդ բացահայտումներին, որ շրջանառվող տրիպտոֆանի մակարդակն ավելի ցածր է թոքերի քաղցկեղով հիվանդների մոտ, քան վերահսկիչ խմբի առողջ վերահսկիչների մոտ33,34: , 35.Մեկ այլ ուսումնասիրություն՝ օգտագործելով PET/CT հետագծող 11C-մեթիլ-L-տրիպտոֆան, պարզվել է, որ թոքերի քաղցկեղի հյուսվածքում տրիպտոֆանի ազդանշանի պահպանման ժամանակը զգալիորեն ավելացել է՝ համեմատած բարորակ վնասվածքների կամ նորմալ հյուսվածքի հետ36:Մենք ենթադրում ենք, որ LA շիճուկում տրիպտոֆանի նվազումը կարող է արտացոլել թոքերի քաղցկեղի բջիջների կողմից տրիպտոֆանի ակտիվ կլանումը:
Հայտնի է նաև, որ տրիպտոֆանի կատաբոլիզմի կինուրենինի ճանապարհի վերջնական արդյունքը NAD+37,38-ն է, որը կարևոր սուբստրատ է գլիցերալդեհիդ-3-ֆոսֆատի և 1,3-բիսֆոսֆոսֆոգլիկերատի հետ գլիկոլիզում39 ռեակցիայի համար:Մինչ նախորդ ուսումնասիրությունները կենտրոնացած էին իմունային կարգավորման մեջ տրիպտոֆանի կատաբոլիզմի դերի վրա, մենք ձգտեցինք պարզաբանել ընթացիկ ուսումնասիրության մեջ դիտարկված տրիպտոֆանի դիսկարգավորման և գլիկոլիտիկ ուղիների փոխազդեցությունը:Հայտնի է, որ լուծված նյութերի փոխադրող ընտանիքի 7 անդամ 5 (SLC7A5) հանդիսանում է տրիպտոֆանի փոխադրող43,44,45:Քինոլինաթթվի ֆոսֆորիբոսիլտրանսֆերազը (QPRT) ֆերմենտ է, որը տեղակայված է կինուրենինի ուղուց ներքև, որը փոխակերպում է քինոլինաթթուն NAMN46-ի:LUAD TCGA տվյալների բազայի ստուգումը ցույց է տվել, որ և՛ SLC7A5, և՛ QPRT-ը զգալիորեն կարգավորվել են ուռուցքային հյուսվածքում՝ համեմատած նորմալ հյուսվածքների հետ (նկ. 5e):Այս աճը նկատվել է թոքերի ադենոկարցինոմայի I և II փուլերում, ինչպես նաև III և IV փուլերում (Լրացուցիչ նկար 11), ինչը ցույց է տալիս տրիպտոֆանի նյութափոխանակության վաղ խանգարումները՝ կապված ուռուցքի առաջացման հետ:
Բացի այդ, LUAD-TCGA տվյալների բազան ցույց տվեց դրական հարաբերակցություն SLC7A5-ի և GAPDH mRNA արտահայտման միջև քաղցկեղով հիվանդների նմուշներում (r = 0.45, p = 1.55E-26, Նկար 5f):Ի հակադրություն, նորմալ թոքերի հյուսվածքում նման գենային ստորագրությունների միջև էական կապ չի հայտնաբերվել (r = 0.25, p = 0.06, Նկար 5f):SLC7A5-ի (Լրացուցիչ նկար 12) անկումը A549 բջիջներում զգալիորեն նվազեցրեց բջջային տրիպտոֆանի և NAD(H) մակարդակները (Նկար 5g,h), ինչը հանգեցնում է գլիկոլիտիկ ակտիվության թուլացմանը, որը չափվում է արտաբջջային թթվայնացման արագությամբ (ECAR) (Նկար 1):5i).Այսպիսով, հիմնվելով շիճուկում մետաբոլիկ փոփոխությունների և in vitro հայտնաբերման վրա, մենք ենթադրում ենք, որ տրիպտոֆանի նյութափոխանակությունը կարող է արտադրել NAD+ կինուրենինի ճանապարհով և կարևոր դեր խաղալ թոքերի քաղցկեղում գլիկոլիզը խթանելու գործում:
Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ LDCT-ով հայտնաբերված մեծ թվով անորոշ թոքային հանգույցներ կարող են հանգեցնել լրացուցիչ հետազոտությունների, ինչպիսիք են PET-CT, թոքերի բիոպսիան և գերբուժումը չարորակ ուռուցքի կեղծ դրական ախտորոշման պատճառով:31 Ինչպես ցույց է տրված Նկար 6-ում. մեր ուսումնասիրությունը հայտնաբերել է շիճուկի մետաբոլիտների մի խումբ, որոնք ունեն պոտենցիալ ախտորոշիչ արժեք, որը կարող է բարելավել ռիսկի շերտավորումը և թոքային հանգույցների հետագա կառավարումը, որոնք հայտնաբերվում են CT-ով:
Թոքային հանգույցները գնահատվում են ցածր չափաբաժիններով հաշվարկված տոմոգրաֆիայի (LDCT) միջոցով՝ բարորակ կամ չարորակ պատճառներ հուշող պատկերային հատկանիշներով:Հանգույցների անորոշ արդյունքը կարող է հանգեցնել հաճախակի հետևողական այցելությունների, անհարկի միջամտությունների և գերբուժման:Շիճուկի նյութափոխանակության դասակարգիչների ներառումը ախտորոշիչ արժեքով կարող է բարելավել ռիսկի գնահատումը և թոքային հանգույցների հետագա կառավարումը:PET պոզիտրոնային էմիսիոն տոմոգրաֆիա.
ԱՄՆ NLST ուսումնասիրության և եվրոպական NELSON հետազոտության տվյալները ցույց են տալիս, որ ցածր չափաբաժիններով համակարգչային տոմոգրաֆիայի (LDCT) բարձր ռիսկային խմբերի սկրինինգը կարող է նվազեցնել թոքերի քաղցկեղից մահացությունը1,3:Այնուամենայնիվ, LDCT-ով հայտնաբերված մեծ թվով պատահական թոքային հանգույցների ռիսկի գնահատումը և հետագա կլինիկական կառավարումը մնում են ամենադժվարը:Հիմնական նպատակն է օպտիմիզացնել գոյություն ունեցող LDCT-ի վրա հիմնված արձանագրությունների ճիշտ դասակարգումը` ներառելով հուսալի բիոմարկերներ:
Որոշ մոլեկուլային բիոմարկերներ, ինչպիսիք են արյան մետաբոլիտները, բացահայտվել են՝ համեմատելով թոքերի քաղցկեղը առողջ վերահսկողների հետ15,17:Ընթացիկ ուսումնասիրության մեջ մենք կենտրոնացել ենք շիճուկի նյութափոխանակության վերլուծության կիրառման վրա՝ LDCT-ով պատահաբար հայտնաբերված բարորակ և չարորակ թոքային հանգույցները տարբերելու համար:Մենք համեմատեցինք առողջ հսկողության (HC), թոքերի բարորակ հանգույցների (BN) և I փուլի թոքերի ադենոկարկինոմայի (LA) նմուշների շիճուկի գլոբալ մետաբոլոմը՝ օգտագործելով UPLC-HRMS վերլուծությունը:Մենք պարզեցինք, որ HC-ն և BN-ն ունեին նմանատիպ նյութափոխանակության պրոֆիլներ, մինչդեռ LA-ն ցույց տվեց զգալի փոփոխություններ՝ համեմատած HC-ի և BN-ի հետ:Մենք հայտնաբերեցինք շիճուկի մետաբոլիտների երկու խումբ, որոնք տարբերում են LA-ն HC-ից և BN-ից:
Բարորակ և չարորակ հանգույցների LDCT-ի վրա հիմնված նույնականացման ներկայիս սխեման հիմնականում հիմնված է հանգույցների չափի, խտության, մորֆոլոգիայի և ժամանակի ընթացքում աճի տեմպերի վրա30:Նախորդ հետազոտությունները ցույց են տվել, որ հանգույցների չափը սերտորեն կապված է թոքերի քաղցկեղի հավանականության հետ։Նույնիսկ բարձր ռիսկային հիվանդների մոտ 6 մմ <1% հանգույցներում չարորակ նորագոյացության վտանգը կազմում է <1%:6-ից 20 մմ չափերով հանգույցների չարորակ ուռուցքի վտանգը տատանվում է 8%-ից 64%30:Հետևաբար, Fleischner Society-ն խորհուրդ է տալիս 6 մմ կտրվածքի տրամագիծը սովորական CT-ի հետևողականության համար:29 Այնուամենայնիվ, ռիսկի գնահատումը և 6 մմ-ից ավելի անորոշ թոքային հանգույցների (IPN) կառավարումը պատշաճ կերպով չեն իրականացվել 31:Սրտի բնածին հիվանդության ներկայիս կառավարումը սովորաբար հիմնված է զգոն սպասման վրա՝ հաճախակի CT մոնիտորինգով:
Վավերացված մետաբոլոմի հիման վրա մենք առաջին անգամ ցուցադրեցինք առողջ անհատների և <6 մմ բարորակ հանգույցների միջև նյութափոխանակության նշանների համընկնումը:Կենսաբանական նմանությունը համընկնում է նախորդ CT բացահայտումների հետ, որ <6 մմ հանգույցների համար չարորակ ուռուցքի ռիսկը նույնքան ցածր է, որքան առանց հանգույցների առարկաների:30 Հարկ է նշել, որ մեր արդյունքները ցույց են տալիս նաև, որ <6 մմ և ≥6 մմ բարորակ հանգույցները բարձր են նյութափոխանակության պրոֆիլների նմանությունը, ինչը ենթադրում է, որ բարորակ էթիոլոգիայի ֆունկցիոնալ սահմանումը համահունչ է անկախ հանգույցի չափից:Այսպիսով, ժամանակակից ախտորոշիչ շիճուկի մետաբոլիտային վահանակները կարող են տրամադրել մեկ անալիզ՝ որպես բացառող թեստ, երբ հանգույցները ի սկզբանե հայտնաբերվում են CT-ում և պոտենցիալ նվազեցնում են սերիական մոնիտորինգը:Միևնույն ժամանակ, նյութափոխանակության բիոմարկերների նույն վահանակը առանձնացրեց ≥6 մմ չափի չարորակ հանգույցները բարորակ հանգույցներից և տրամադրեց ճշգրիտ կանխատեսումներ նույն չափի IPN-ների և ոչ միանշանակ մորֆոլոգիական առանձնահատկությունների համար CT պատկերների վրա:Շիճուկային նյութափոխանակության այս դասակարգիչը լավ է կատարել ≥6 մմ հանգույցների չարորակ ուռուցքը կանխատեսելիս՝ AUC-ով 0,927:Միասին մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ շիճուկի եզակի նյութափոխանակության նշանները կարող են հատուկ արտացոլել վաղ ուռուցքից առաջացած մետաբոլիկ փոփոխությունները և ունենալ պոտենցիալ արժեք՝ որպես ռիսկի կանխատեսումներ՝ անկախ հանգույցների չափից:
Հատկանշական է, որ թոքերի ադենոկարցինոման (LUAD) և տափակ բջջային քաղցկեղը (LUSC) թոքերի ոչ մանր բջջային քաղցկեղի (NSCLC) հիմնական տեսակներն են:Հաշվի առնելով, որ LUSC-ը սերտորեն կապված է ծխախոտի օգտագործման հետ47, և LUAD-ը թոքերի պատահական հանգույցների ամենատարածված հիստոլոգիան է, որը հայտնաբերվել է CT ցուցադրման ժամանակ48, մեր դասակարգիչ մոդելը հատուկ ստեղծվել է I փուլի ադենոկարցինոմայի նմուշների համար:Վանգը և գործընկերները նաև կենտրոնացան LUAD-ի վրա և հայտնաբերեցին ինը լիպիդային նշաններ՝ օգտագործելով լիպիդոմիկա՝ թոքերի վաղ փուլի քաղցկեղը առողջ մարդկանցից տարբերելու համար17:Մենք փորձարկեցինք դասակարգչի ընթացիկ մոդելը I աստիճանի LUSC-ի 16 դեպքի և 74 բարորակ հանգույցների վրա և նկատեցինք LUSC կանխատեսման ցածր ճշգրտություն (AUC 0,776), ինչը ենթադրում է, որ LUAD-ը և LUSC-ն կարող են ունենալ իրենց սեփական նյութափոխանակության նշանները:Իրոք, LUAD-ը և LUSC-ը տարբերվում են պատճառաբանությամբ, կենսաբանական ծագմամբ և գենետիկական շեղումներով49:Հետևաբար, հյուսվածքաբանության այլ տեսակներ պետք է ներառվեն սքրինինգային ծրագրերում թոքերի քաղցկեղի բնակչության վրա հիմնված հայտնաբերման վերապատրաստման մոդելներում:
Այստեղ մենք հայտնաբերեցինք թոքերի ադենոկարցինոմայի վեց առավել հաճախ փոփոխվող ուղիները՝ համեմատած առողջ հսկիչների և բարորակ հանգույցների հետ:Քսանթինը և հիպոքսանտինը պուրինային նյութափոխանակության ուղու սովորական մետաբոլիտներ են:Մեր արդյունքներին համապատասխան՝ պուրինային նյութափոխանակության հետ կապված միջանկյալ նյութերը զգալիորեն ավելացել են թոքերի ադենոկարցինոմայով հիվանդների շիճուկում կամ հյուսվածքներում՝ համեմատած առողջ հսկիչների կամ նախաինվազիվ փուլում գտնվող հիվանդների հետ15,50:Շիճուկում քսանտինի և հիպոքսանտինի բարձր մակարդակը կարող է արտացոլել անաբոլիզմը, որն անհրաժեշտ է արագորեն բազմացող քաղցկեղային բջիջների համար:Գլյուկոզայի նյութափոխանակության դիսկարգավորումը քաղցկեղի նյութափոխանակության հայտնի հատկանիշն է51:Այստեղ մենք նկատեցինք պիրուվատի և լակտատի զգալի աճ LA խմբում՝ համեմատած HC և BN խմբերի հետ, ինչը համահունչ է ոչ փոքր բջջային թոքերի քաղցկեղով (NSCLC) հիվանդների շիճուկի նյութափոխանակության պրոֆիլներում գլիկոլիտիկ ուղիների աննորմալությունների վերաբերյալ նախորդ զեկույցներին: առողջ հսկողություն:արդյունքները համահունչ են52,53:
Կարևոր է, որ մենք նկատեցինք հակադարձ հարաբերակցություն պիրուվատի և տրիպտոֆանի նյութափոխանակության միջև թոքերի ադենոկարցինոմայի շիճուկում:Շիճուկում տրիպտոֆանի մակարդակը LA խմբում նվազել է HC կամ BN խմբի համեմատ:Հետաքրքիր է, որ նախորդ լայնածավալ հետազոտությունը, որն օգտագործեց հեռանկարային խումբ, ցույց տվեց, որ շրջանառվող տրիպտոֆանի ցածր մակարդակը կապված է թոքերի քաղցկեղի բարձր ռիսկի հետ 54:Տրիպտոֆանը էական ամինաթթու է, որը մենք ամբողջությամբ ստանում ենք սննդից:Մենք եզրակացնում ենք, որ շիճուկում տրիպտոֆանի սպառումը թոքերի ադենոկարկինոմայում կարող է արտացոլել այս մետաբոլիտի արագ սպառումը:Հայտնի է, որ տրիպտոֆանի կատաբոլիզմի վերջնական արդյունքը կինուրենինի ճանապարհով հանդիսանում է de novo NAD+ սինթեզի աղբյուրը:Քանի որ NAD+-ն արտադրվում է հիմնականում փրկարար ուղու միջոցով, NAD+-ի կարևորությունը տրիպտոֆանի նյութափոխանակության մեջ առողջության և հիվանդության մեջ դեռևս պետք է որոշվի46:TCGA տվյալների բազայի մեր վերլուծությունը ցույց է տվել, որ տրիպտոֆան փոխադրող լուծույթի փոխադրիչ 7A5 (SLC7A5) էքսպրեսիան զգալիորեն ավելացել է թոքերի ադենոկարցինոմայում՝ համեմատած նորմալ հսկիչների հետ և դրականորեն փոխկապակցված է GAPDH գլիկոլիտիկ ֆերմենտի արտահայտման հետ:Նախորդ ուսումնասիրությունները հիմնականում կենտրոնացած էին տրիպտոֆանի կատաբոլիզմի դերի վրա՝ ճնշելու հակաուռուցքային իմունային պատասխանը40,41,42:Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս, որ թոքերի քաղցկեղի բջիջներում SLC7A5-ի նոկդաունի միջոցով տրիպտոֆանի կլանման արգելակումը հանգեցնում է բջջային NAD մակարդակի հետագա նվազմանը և գլիկոլիտիկ ակտիվության ուղեկցող թուլացմանը:Ամփոփելով, մեր ուսումնասիրությունը կենսաբանական հիմք է տալիս շիճուկի նյութափոխանակության փոփոխությունների համար՝ կապված թոքերի ադենոկարցինոմայի չարորակ վերափոխման հետ:
EGFR մուտացիաները NSCLC ունեցող հիվանդների մոտ ամենատարածված վարորդ մուտացիաներն են:Մեր ուսումնասիրության ընթացքում մենք պարզեցինք, որ EGFR մուտացիայով հիվանդները (n = 41) ունեին ընդհանուր նյութափոխանակության պրոֆիլներ, որոնք նման էին վայրի տիպի EGFR-ով հիվանդներին (n = 31), թեև ացիլկարնիտինով հիվանդների մոտ հայտնաբերեցինք EGFR մուտանտի որոշ հիվանդների շիճուկի մակարդակի նվազում:Acylcarnitines-ի հաստատված գործառույթը ցիտոպլազմից ացիլային խմբերի տեղափոխումն է միտոքոնդրիալ մատրիցա՝ հանգեցնելով ճարպաթթուների օքսիդացմանը՝ էներգիա արտադրելու համար 55 ։Համահունչ մեր գտածոներին՝ վերջերս կատարած ուսումնասիրությունը նաև հայտնաբերել է նյութափոխանակության նմանատիպ պրոֆիլներ EGFR մուտանտի և EGFR վայրի տիպի ուռուցքների միջև՝ վերլուծելով թոքերի ադենոկարցինոմայի 102 հյուսվածքի նմուշների գլոբալ մետաբոլոմը50:Հետաքրքիր է, որ ացիլկարնիտինի պարունակությունը հայտնաբերվել է նաև EGFR մուտանտների խմբում:Հետևաբար, արդյոք ացիլկարնիտինի մակարդակների փոփոխությունները արտացոլում են EGFR-ով առաջացած նյութափոխանակության փոփոխությունները և հիմքում ընկած մոլեկուլային ուղիները, կարող են արժանի լինել հետագա ուսումնասիրության:
Եզրափակելով, մեր ուսումնասիրությունը սահմանում է շիճուկի նյութափոխանակության դասակարգիչը թոքային հանգույցների դիֆերենցիալ ախտորոշման համար և առաջարկում է աշխատանքային հոսք, որը կարող է օպտիմալացնել ռիսկի գնահատումը և հեշտացնել կլինիկական կառավարումը` հիմնված CT սկանավորման վրա:
Այս ուսումնասիրությունը հավանության է արժանացել Սուն Յաթ-սեն համալսարանական քաղցկեղի հիվանդանոցի, Սուն Յատ-սեն համալսարանի առաջին փոխկապակցված հիվանդանոցի և Չժենչժոուի համալսարանական քաղցկեղի հիվանդանոցի էթիկայի հանձնաժողովի կողմից:Բացահայտման և ներքին վավերացման խմբերում 174 շիճուկ առողջ անհատներից և 244 շիճուկներ բարորակ հանգույցներից հավաքվել են այն մարդկանցից, ովքեր տարեկան բժշկական հետազոտություններ էին անցնում Քաղցկեղի վերահսկման և կանխարգելման բաժանմունքում, Սուն Յաթ-սեն համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնում և 166 բարորակ հանգույցներ:շիճուկ.I աստիճանի թոքերի ադենոկարցինոման հավաքագրվել է Սուն Յաթ-սեն համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնից:Արտաքին վավերացման կոհորտում գրանցվել է բարորակ հանգույցների 48 դեպք, թոքերի ադենոկարկինոմայի I աստիճանի 39 դեպք Սուն Յաթ-Սենի համալսարանի Առաջին կից հիվանդանոցից և 24 դեպք՝ I փուլի թոքերի ադենոկարցինոմայի՝ Չժենչժոուի քաղցկեղի հիվանդանոցից:Սուն Յաթ-Սենի համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնը նաև հավաքել է թոքերի 1 փուլի տափակ բջջային քաղցկեղի 16 դեպք՝ հաստատված նյութափոխանակության դասակարգչի ախտորոշիչ կարողությունը ստուգելու համար (հիվանդի բնութագրերը ներկայացված են Լրացուցիչ Աղյուսակ 5-ում):Նմուշներ հայտնաբերման և ներքին վավերացման խմբերից հավաքվել են 2018 թվականի հունվարից մինչև 2020 թվականի մայիս ընկած ժամանակահատվածում: Արտաքին վավերացման խմբի նմուշները հավաքվել են 2021 թվականի օգոստոսից մինչև 2022 թվականի հոկտեմբեր ընկած ժամանակահատվածում: Գենդերային կողմնակալությունը նվազագույնի հասցնելու համար յուրաքանչյուրին հատկացվել է մոտավորապես հավասար թվով արական և իգական սեռի դեպքեր: խումբ.Discovery թիմ և ներքին վերանայման թիմ:Մասնակիցների սեռը որոշվել է ինքնազեկուցման հիման վրա:Բոլոր մասնակիցներից ստացվել է տեղեկացված համաձայնություն և փոխհատուցում չի տրվել:Բարորակ հանգույցներով սուբյեկտները վերլուծության պահին 2-ից 5 տարվա ընթացքում CT սկանավորման կայուն գնահատական ​​ունեն, բացառությամբ 1 դեպքի արտաքին վավերացման նմուշից, որը հավաքվել է նախավիրահատական ​​և ախտորոշվել է հիստոպաթոլոգիայի միջոցով:Բացառությամբ քրոնիկ բրոնխիտի:Թոքերի ադենոկարկինոմայի դեպքերը հավաքագրվել են մինչև թոքերի մասնահատումը և հաստատվել պաթոլոգիական ախտորոշմամբ:Ծոմ պահող արյան նմուշները հավաքվել են շիճուկի բաժանման խողովակներում՝ առանց հակամակարդիչի:Արյան նմուշները մակարդվել են 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում, այնուհետև ցենտրիֆուգվել են 2851 × գ 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում՝ շիճուկի վերին նյութը հավաքելու համար:Շիճուկի մասնիկները սառեցվել են -80°C-ում մինչև մետաբոլիտի արդյունահանումը:Սուն Յաթ-սեն համալսարանի քաղցկեղի կենտրոնի քաղցկեղի կանխարգելման և բժշկական հետազոտության բաժանմունքը հավաքել է շիճուկ 100 առողջ դոնորներից, այդ թվում՝ 40-ից 55 տարեկան տղամարդկանց և կանանց հավասար թվով:Յուրաքանչյուր դոնորի նմուշի հավասար ծավալները խառնվել են, արդյունքում ստացված ավազանը բաժանվել է և պահվել -80°C ջերմաստիճանում:Շիճուկի խառնուրդն օգտագործվել է որպես որակի վերահսկման և տվյալների ստանդարտացման տեղեկատու նյութ:
Հղման շիճուկը և փորձանմուշները հալվել են, և մետաբոլիտները արդյունահանվել են՝ օգտագործելով համակցված արդյունահանման մեթոդը (MTBE/մեթանոլ/ջուր) 56:Հակիրճ, 50 մկլ շիճուկը խառնվեց 225 մկլ սառցե մեթանոլի և 750 մկլ սառցե մեթիլ տերտ-բութիլ եթերի (MTBE) հետ:Խառնել խառնուրդը և 1 ժամ ինկուբացնել սառույցի վրա։Այնուհետև նմուշները խառնվել են և խառնվել 188 մկլ MS-որակի ջրի հետ, որը պարունակում է ներքին ստանդարտներ (13C-լակտատ, 13C3-պիրուվատ, 13C-մեթիոնին և 13C6-իզոլեյցին, որը ձեռք է բերվել Cambridge Isotope Laboratories-ից):Այնուհետև խառնուրդը ցենտրիֆուգվել է 15000 × գ 10 րոպե 4 °C-ում, իսկ ստորին փուլը տեղափոխվել է երկու խողովակի մեջ (յուրաքանչյուրը 125 մկլ)՝ LC-MS վերլուծության համար դրական և բացասական ռեժիմներով:Ի վերջո, նմուշը գոլորշիացվել է մինչև չորանալը բարձր արագությամբ վակուումային խտանյութում:
Չորացրած մետաբոլիտները վերականգնվել են 120 մկլ 80% ացետոնիտրիլի մեջ, պտտվել 5 րոպե և ցենտրիֆուգվել 15000 × գ 10 րոպե 4°C-ում:Սուպերնատենտները տեղափոխվեցին սաթ ապակե սրվակներ՝ միկրոներդիրներով՝ նյութափոխանակության ուսումնասիրությունների համար:Ոչ նպատակային նյութափոխանակության վերլուծություն գերարդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի-բարձր լուծաչափի զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (UPLC-HRMS) հարթակի վրա:Մետաբոլիտներն առանձնացվել են՝ օգտագործելով Dionex Ultimate 3000 UPLC համակարգ և ACQUITY BEH Amide սյունակ (2,1 × 100 մմ, 1,7 մկմ, ջրեր):Դրական իոնային ռեժիմում շարժական փուլերը կազմում էին 95% (A) և 50% ացետոնիտրիլ (B), որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում էր 10 մմոլ/լ ամոնիումի ացետատ և 0,1% մոնջաթթու:Բացասական ռեժիմում շարժական A և B փուլերը պարունակում էին համապատասխանաբար 95% և 50% ացետոնիտրիլ, երկու փուլերն էլ պարունակում էին 10 մմոլ/լ ամոնիումի ացետատ, pH = 9: Գրադիենտ ծրագիրը հետևյալն էր. 0–0,5 րոպե, 2% B;0,5–12 րոպե, 2–50% B;12–14 րոպե, 50–98% B;14–16 րոպե, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1–20 րոպե, 2% B. Սյունակը պահպանվել է 40°C-ում, իսկ նմուշը 10°C-ում՝ ավտոսամպլերում:Հոսքի արագությունը 0,3 մլ/րոպե էր, ներարկման ծավալը՝ 3 մկլ:Q-Exactive Orbitrap զանգվածային սպեկտրոմետրը (Thermo Fisher Scientific) էլեկտրասփրեյ իոնացման (ESI) աղբյուրով գործարկվել է ամբողջական սկանավորման ռեժիմով և միացված է ddMS2 մոնիտորինգի ռեժիմին՝ մեծ ծավալի տվյալներ հավաքելու համար:MS-ի պարամետրերը սահմանվել են հետևյալ կերպ՝ լակի լարումը +3,8 կՎ/- 3,2 կՎ, մազանոթային ջերմաստիճանը 320°C, պաշտպանիչ գազը 40 արբ, օժանդակ գազը 10 արբ, զոնդի ջեռուցիչի ջերմաստիճանը 350°C, սկանավորման միջակայքը 70–1050 մ/ժ, բանաձեւը։70 000: Տվյալները ձեռք են բերվել Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) օգտագործմամբ:
Տվյալների որակը գնահատելու համար ստեղծվել են որակի վերահսկման (QC) նմուշներ՝ յուրաքանչյուր նմուշից հեռացնելով 10 մկլ վերին նյութի մասնաբաժինը:Որակի վերահսկման վեց նմուշի ներարկումներ վերլուծվել են վերլուծական հաջորդականության սկզբում՝ UPLC-MS համակարգի կայունությունը գնահատելու համար:Որակի վերահսկման նմուշներն այնուհետև պարբերաբար ներմուծվում են խմբաքանակ:Այս հետազոտության մեջ շիճուկի բոլոր 11 խմբաքանակները վերլուծվել են LC-MS-ով:100 առողջ դոնորներից ստացված շիճուկային լողավազանի խառնուրդի մասնիկները օգտագործվել են որպես տեղեկատու նյութ համապատասխան խմբաքանակներում արդյունահանման գործընթացը վերահսկելու և սերիա-խմբաքանակ ազդեցությունները հարմարեցնելու համար:Բացահայտումների կոհորտայի, ներքին վավերացման և արտաքին վավերացման խմբի ոչ նպատակային մետաբոլոմիկայի վերլուծությունը կատարվել է Սուն Յաթ-սեն համալսարանի Մետաբոլոմիկայի կենտրոնում:Գուանդունի տեխնոլոգիական համալսարանի վերլուծության և թեստավորման կենտրոնի արտաքին լաբորատորիան նաև վերլուծել է 40 նմուշ արտաքին կոհորտից՝ դասակարգիչի մոդելի աշխատանքը ստուգելու համար:
Արդյունահանումից և վերականգնումից հետո շիճուկի մետաբոլիտների բացարձակ քանակությունը չափվել է՝ օգտագործելով գերբարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիա (Agilent 6495 եռակի քառաբևեռ) էլեկտրասփրեյի իոնացման (ESI) աղբյուրով բազմակի ռեակցիայի մոնիտորինգի (MRM) ռեժիմում:ACQUITY BEH ամիդային սյունակ (2,1 × 100 մմ, 1,7 մկմ, ջրեր) օգտագործվել է մետաբոլիտների առանձնացման համար:Շարժական փուլը բաղկացած էր 90% (A) և 5% ացետոնիտրիլից (B) 10 մմոլ/լ ամոնիումի ացետատով և 0,1% ամոնիակի լուծույթով:Գրադիենտ ծրագիրը հետևյալն էր. 0–1,5 րոպե, 0% B;1,5–6,5 րոպե, 0–15% B;6,5–8 րոպե, 15% B;8–8,5 րոպե, 15%–0% B;8,5–11,5 րոպե, 0% Բ.Սյունակը պահպանվել է 40 °C-ում, իսկ նմուշը 10 °C-ում՝ ավտոսամպլերում:Հոսքի արագությունը 0,3 մլ/րոպե էր, իսկ ներարկման ծավալը՝ 1 մկլ:MS-ի պարամետրերը սահմանվել են հետևյալ կերպ՝ մազանոթային լարումը ±3,5 կՎ, նեբուլայզատորի ճնշումը 35 psi, պատյան գազի հոսքը 12 լ/րոպե, պատյան գազի ջերմաստիճանը 350°C, չորացման գազի ջերմաստիճանը 250°C, չորացման գազի հոսքը՝ 14 լ/րոպե։Տրիպտոֆանի, պիրուվատի, լակտատի, հիպոքսանտինի և քսանտինի MRM փոխարկումները եղել են 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 և 151.0–107:9 համապատասխանաբար:Տվյալները հավաքագրվել են Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) միջոցով:Շիճուկի նմուշների համար տրիպտոֆանը, պիրուվատը, լակտատը, հիպոքսանտինը և քսանտինը քանակականացվել են՝ օգտագործելով ստանդարտ խառնուրդի լուծույթների տրամաչափման կորերը:Բջջային նմուշների համար տրիպտոֆանի պարունակությունը նորմալացվել է ներքին ստանդարտին և բջջային սպիտակուցի զանգվածին:
Պիկ արդյունահանումը (m/z և պահպանման ժամանակ (RT)) իրականացվել է Compound Discovery 3.1 և TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) օգտագործմամբ:Խմբաքանակների միջև պոտենցիալ տարբերությունները վերացնելու համար փորձանմուշի յուրաքանչյուր բնորոշ գագաթը բաժանվել է նույն խմբաքանակից հղվող նյութի բնորոշ գագաթին` հարաբերական առատությունը ստանալու համար:Ստանդարտացումից առաջ և հետո ներքին ստանդարտների հարաբերական ստանդարտ շեղումները ցույց են տրված Լրացուցիչ Աղյուսակ 6-ում: Երկու խմբերի միջև տարբերությունները բնութագրվում էին կեղծ հայտնաբերման գործակիցով (FDR<0.05, Wilcoxon signed rank test) և ծալովի փոփոխությամբ (>1.2 կամ <0.83):Հումքային MS տվյալները արդյունահանված հատկանիշների և տեղեկատու շիճուկով շտկված MS տվյալները ցուցադրված են համապատասխանաբար Լրացուցիչ տվյալներ 1 և Լրացուցիչ տվյալներ 2-ում:Պիկ անոտացիան կատարվել է նույնականացման չորս սահմանված մակարդակների հիման վրա, ներառյալ հայտնաբերված մետաբոլիտները, ենթադրաբար ծանոթագրված միացությունները, ենթադրաբար բնութագրվող միացությունների դասերը և անհայտ միացությունները 22:Compound Discovery 3.1-ում (mzCloud, HMDB, Chemspider) տվյալների բազայի որոնումների հիման վրա կենսաբանական միացություններ, որոնց MS/MS համապատասխանող վավերացված ստանդարտները կամ ճշգրիտ համընկնումի ծանոթագրությունները mzCloud-ում (միավոր > 85) կամ Chemspider-ում վերջապես ընտրվել են որպես միջանկյալ նյութեր դիֆերենցիալ նյութափոխանակության միջև:Յուրաքանչյուր հատկանիշի գագաթնակետային ծանոթագրությունները ներառված են Լրացուցիչ տվյալների 3-ում: MetaboAnalyst 5.0-ն օգտագործվել է գումարի նորմալացված մետաբոլիտների առատության միակողմանի վերլուծության համար:MetaboAnalyst 5.0-ը նաև գնահատել է KEGG ճանապարհի հարստացման վերլուծությունը՝ հիմնված զգալիորեն տարբեր մետաբոլիտների վրա:Հիմնական բաղադրիչի վերլուծությունը (PCA) և մասնակի նվազագույն քառակուսիների դիսկրիմինանտ վերլուծությունը (PLS-DA) վերլուծվել են՝ օգտագործելով ropls ծրագրային փաթեթը (v.1.26.4)՝ կույտերի նորմալացումով և ավտոմատ մասշտաբով:Օպտիմալ մետաբոլիտի բիոմարկերի մոդելը՝ հանգույցների չարորակ ուռուցքը կանխատեսելու համար, ստեղծվել է երկուական լոգիստիկ ռեգրեսիայի միջոցով՝ նվազագույն բացարձակ նեղացումով և ընտրության օպերատորով (LASSO, R փաթեթ v.4.1-3):Հայտնաբերման և վավերացման հավաքածուներում տարբերակիչ մոդելի կատարումը բնութագրվում էր ROC վերլուծության հիման վրա AUC-ի գնահատմամբ՝ համաձայն pROC փաթեթի (v.1.18.0.):Օպտիմալ հավանականության կտրվածքը ստացվել է մոդելի առավելագույն Youden ինդեքսի հիման վրա (զգայունություն + կոնկրետություն – 1):Շեմից փոքր կամ ավելի մեծ արժեք ունեցող նմուշները համապատասխանաբար կկանխատեսվեն որպես բարորակ հանգույցներ և թոքերի ադենոկարցինոմա:
A549 բջիջները (#CCL-185, American Type Culture Collection) աճեցվել են F-12K միջավայրում, որը պարունակում է 10% FBS:Կարճ վարսահարդարիչ ՌՆԹ (shRNA) հաջորդականություններ, որոնք ուղղված են SLC7A5-ին և ոչ թիրախային հսկիչին (NC) տեղադրվել են lentiviral vector pLKO.1-puro-ի մեջ:shSLC7A5-ի հակասիտային հաջորդականությունները հետևյալն են՝ Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′):SLC7A5-ի (#5347) և տուբուլինի (#2148) հակամարմինները գնվել են «Cell Signaling Technology»-ից:SLC7A5-ի և տուբուլինի նկատմամբ հակամարմինները օգտագործվել են 1:1000 նոսրացման դեպքում Western blot վերլուծության համար:
Seahorse XF Glycolytic Stress Test-ը չափում է արտաբջջային թթվայնացման (ECAR) մակարդակը:Փորձարկման ժամանակ գլյուկոզա, օլիգոմիցին A և 2-DG հաջորդաբար կիրառվել են՝ ECAR-ով չափված բջջային գլիկոլիտիկ կարողությունը ստուգելու համար:
A549 բջիջները, որոնք տրանսֆեկցված էին ոչ թիրախային հսկիչով (NC) և shSLC7A5 (Sh1, Sh2) բջիջները մեկ գիշերվա ընթացքում 10 սմ տրամագծով ափսեներում տեղադրվեցին:Բջջային մետաբոլիտներն արդյունահանվել են 1 մլ սառցե 80% ջրային մեթանոլով:Մեթանոլի լուծույթի բջիջները քերվել են, հավաքվել նոր խողովակի մեջ և ցենտրիֆուգվել 15000 × գ 15 րոպե 4°C ջերմաստիճանում:Հավաքեք 800 մկլ սուպերնատենտ և չորացրեք՝ օգտագործելով բարձր արագությամբ վակուումային խտացուցիչ:Չորացրած մետաբոլիտի գնդիկները այնուհետև վերլուծվել են տրիպտոֆանի մակարդակների համար՝ օգտագործելով LC-MS/MS, ինչպես նկարագրված է վերևում:Բջջային NAD(H) մակարդակները A549 բջիջներում (NC և shSLC7A5) չափվել են քանակական NAD+/NADH գունաչափական հավաքածուի միջոցով (#K337, BioVision)՝ ըստ արտադրողի ցուցումների:Յուրաքանչյուր նմուշի համար չափվել է սպիտակուցի մակարդակը՝ մետաբոլիտների քանակությունը նորմալացնելու համար:
Ընտրանքի չափը նախնական որոշելու համար վիճակագրական մեթոդներ չեն օգտագործվել:Նախորդ մետաբոլոմիկայի ուսումնասիրությունները, որոնք ուղղված են բիոմարկերի հայտնաբերմանը15,18, դիտարկվել են որպես չափի որոշման չափանիշ, և այս զեկույցների համեմատ մեր ընտրանքը համարժեք էր:Ոչ մի նմուշ չի բացառվել հետազոտական ​​խմբից:Շիճուկի նմուշները պատահականորեն նշանակվել են հայտնաբերման խմբին (306 դեպք, 74,6%) և ներքին վավերացման խմբին (104 դեպք, 25,4%)՝ նյութափոխանակության ոչ նպատակային ուսումնասիրությունների համար:Մենք նաև պատահականորեն ընտրեցինք 70 դեպք յուրաքանչյուր խմբից նյութափոխանակության նպատակային ուսումնասիրությունների համար նախատեսված հայտնագործություններից:LC-MS տվյալների հավաքագրման և վերլուծության ընթացքում քննիչները կուրացած են եղել խմբային հանձնարարության համար:Նյութափոխանակության տվյալների և բջիջների փորձերի վիճակագրական վերլուծությունները նկարագրված են Արդյունքներ, Նկարների լեգենդներ և Մեթոդներ բաժիններում:Բջջային տրիպտոֆանի, NADT-ի և գլիկոլիտիկ ակտիվության քանակական գնահատումը կատարվել է երեք անգամ անկախ՝ նույնական արդյունքներով:
Ուսումնասիրության նախագծման մասին լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս այս հոդվածի հետ կապված «Բնական պորտֆոլիո զեկույցի ամփոփագիրը»:
Արդյունահանված հատկանիշների չմշակված MS տվյալները և հղման շիճուկի նորմալացված MS տվյալները ցուցադրված են համապատասխանաբար Լրացուցիչ տվյալների 1-ում և լրացուցիչ տվյալների 2-ում:Դիֆերենցիալ հատկանիշների գագաթնակետային նշումները ներկայացված են Լրացուցիչ տվյալներ 3-ում: LUAD TCGA տվյալների բազան կարելի է ներբեռնել https://portal.gdc.cancer.gov/ կայքից:Գրաֆիկի գծագրման համար մուտքային տվյալները ներկայացված են սկզբնաղբյուրի տվյալների մեջ:Աղբյուրի տվյալները տրամադրվում են այս հոդվածի համար:
Թոքերի հետազոտման ազգային խումբ և այլն: Թոքերի քաղցկեղից մահացության նվազեցում ցածր չափաբաժիններով համակարգչային տոմոգրաֆիայի միջոցով:Հյուսիսային Անգլիա.J. Med.365, 395–409 (2011):
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR and Prophet, PC Թոքերի քաղցկեղի սկրինինգ՝ օգտագործելով ցածր դոզայի պտուտակավոր CT. Թոքերի ազգային զննման ուսումնասիրության արդյունքները (NLST):J. Med.Էկրան 18, 109–111 (2011):
De Koning, HJ, et al.Թոքերի քաղցկեղից մահացության նվազեցում ծավալային CT ցուցադրմամբ՝ պատահական փորձարկումով:Հյուսիսային Անգլիա.J. Med.382, 503–513 (2020):