CRISPR)-ը երրորդ սերնդի գենոմի խմբագրման տեխնիկա է. CRISPR-ը հեղափոխություն կատարեց աշխարհում

Կլաստերային կանոնավոր կերպով միջակայված կարճ պալինդրոմային կրկնությունները (CRISPR) երրորդ սերնդի գենոմի խմբագրման տեխնիկա է, որը հեղափոխություն է մտցրել աշխարհում իր բարձր արդյունավետությամբ։ Այն օգտագործվել է տարբեր կենսաբանական հիվանդությունների և վարակների բուժման համար։ Տարբեր մանրէներ և այլ պրոկարիոտներ (օրինակ՝ արքեաներ) նույնպես ունեն CRISPR/Cas9 համակարգեր՝ ֆագերից պաշտպանվելու համար։ Հաղորդվել է, որ CRISPR/Cas9-ի վրա հիմնված ռազմավարությունները կարող են կանխել եռակի բացասական կրծքագեղձի քաղցկեղի (TNBC) աճը և առաջընթացը՝ թիրախավորելով պոտենցիալ փոփոխված դիմադրության գեները, տրանսկրիպցիան և էպիգենետիկ կարգավորումը։ Այս թերապևտիկ միջամտությունները կարող են օգնել լուծել մարտահրավերային խնդիրներ, ինչպիսիք են դեղորայքային դիմադրողականությունը, որը դիտվում է նույնիսկ TNBC-ում։ Ներկայումս CRISPR/Cas9-ը թիրախային բջիջներին հասցնելու համար օգտագործվում են տարբեր մեթոդներ, ինչպիսիք են ֆիզիկական (միկրոինեկցիա, էլեկտրոպորացիա և հիդրոդինամիկ ռեժիմներ), վիրուսային (ադենո-կապակցված վիրուս և լենտիվիրուս) և ոչ վիրուսային (լիպոսոմներ և լիպիդային նանոմասնիկներ)։ Չնայած մշակվել են տարբեր մոդելներ՝ տրանսգենդերային չարորակ ուռուցքների (ՏՉԲ) մոլեկուլային պատճառները ուսումնասիրելու համար, in vivo գենոմի խմբագրման գործիքների կիրառման զգայուն և թիրախային մեթոդների բացակայությունը սահմանափակում է դրանց կլինիկական կիրառումը: Ամփոփելով՝ այս ակնարկը համապարփակ կերպով ուսումնասիրում է ՏՉԲ-ի CRISPR/Cas9 բուժման առաջընթացը, մարտահրավերները, սահմանափակումները և հեռանկարները՝ հիմնվելով առկա ապացույցների վրա: Մենք նաև ընդգծում ենք, թե ինչպես կարող է արհեստական ​​բանականության և մեքենայական ուսուցման համադրությունը բարելավել CRISPR/Cas9 ռազմավարությունները ՏՉԲ-ի բուժման մեջ:
Քաղցկեղը բնութագրվում է անվերահսկելի բջջային բաժանմամբ, բջջային ցիկլի ստուգիչ կետերի խափանումով և ուռուցքի ճնշող գեների (TSG) մուտացիաներով (Matthews et al., 2022): Քաղցկեղի տարբեր տեսակների շարքում կրծքագեղձի քաղցկեղը կանանց մոտ ամենատարածված քաղցկեղի տեսակն է և ունի բարձր մահացության մակարդակ ամբողջ աշխարհում (Waks and Winer, 2019): Կրծքագեղձի քաղցկեղը տարասեռ հիվանդություն է՝ բազմազան բնութագրերով, ինչպիսիք են հյուսվածաբանական և կենսաբանական առանձնահատկությունները, կլինիկական դրսևորումը և վարքագիծը, ինչպես նաև բուժման նկատմամբ արձագանքը (Weigelt et al., 2010): Կրծքագեղձի քաղցկեղի դասակարգումը ճշգրիտ պատկերացում է տալիս կրծքագեղձի քաղցկեղի ախտորոշման և ուռուցքի կանխատեսման վերաբերյալ: Կրծքագեղձի քաղցկեղի դասակարգման հիմնական չափանիշը եղել է ընդհանուր բիոմարկերների և կլինիկա-ախտաբանական առանձնահատկությունների օգտագործումը (Tsang and Tse, 2019): Կրծքագեղձի քաղցկեղի կանխատեսումը և բուժման նկատմամբ արձագանքը կախված են բազմաթիվ գործոններից, այդ թվում՝ էստրոգենի ընկալիչի (ER), պրոգեստերոնի ընկալիչի (PR), մարդու էպիդերմալ աճի գործոնի ընկալիչ 2-ի (HER2/neu) առկայությունից, ինչպես նաև հյուսվածաբանական աստիճանից, ուռուցքի տեսակից և աստիճանից: չափը և լիմֆատիկ հանգույցների մետաստազը (Ալ-Տուբաիթի, 2020): Բացահայտվել են կրծքագեղձի քաղցկեղի հինգ ներքին մոլեկուլային ենթատիպեր, այդ թվում՝ լուսանցքային A, լուսանցքային B, HER2-հարստացված, բազալանման և կլաուդին-լոյ (Պրատ և այլք, 2015): TNBC-ն քաղցկեղի մոլեկուլային ենթատիպ է, որը չի արտահայտում բոլոր ER, PR և HER2-ը (Յին և այլք, 2020): Այս պաթոլոգիական առանձնահատկությունները կապված են TNBC-ի հետ, հաստատելով դրա արագ զարգացումը և ավելի ագրեսիվ բնույթը, քան կրծքագեղձի քաղցկեղի ցանկացած այլ տեսակ (Ֆենգ և այլք, 2018): Բացի այդ, Պերուն և այլք (2000) օգտագործել են միկրոշարքային տեխնոլոգիա՝ կրծքագեղձի քաղցկեղը վերադասակարգելու և կրծքագեղձի քաղցկեղի հինգ ներքին ենթատիպեր բացահայտելու համար (Կադենաս, 2012): Բազալանման կրծքագեղձի քաղցկեղը կրծքագեղձի քաղցկեղի ենթատիպ է, որն ունի եռակի բացասական ֆենոտիպ և կապված է արագ զարգացման հետ: Պետք է նշել, որ բոլոր բազալանման կրծքագեղձի քաղցկեղները սովորաբար սխալմամբ ախտորոշվում են որպես կրծքագեղձի քաղցկեղի նորագոյացություններ (TNBC), սակայն դրանց միայն 77%-ն է TNBC։ Ի տարբերություն դրա, TNBC-ների 71–91%-ը բազալանման է, ինչը ցույց է տալիս, որ կրծքագեղձի քաղցկեղի այս երկու տեսակները համընկնում են և ներկայացնում են տարբեր դասակարգումներ (Wang D.-Y. et al., 2019): Սա ստեղծում է TNBC-ի տարասեռությունը բնութագրելու անհրաժեշտություն՝ կանխատեսումը պարզաբանելու և ներկա և ապագա բուժումներին հնարավոր արձագանքները բացահայտելու համար: Բացի այդ, TNBC-ն կազմում է կրծքագեղձի քաղցկեղի բոլոր դեպքերի 15–20%-ը և ավելի տարածված է 50 տարեկանից փոքր կանանց մոտ: BRCA1 կամ BRCA2 մուտացիաներ են հայտնաբերվել TNBC դեպքերի մոտավորապես 20%-ում (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020): Ուսումնասիրությունները նաև ցույց են տվել, որ TNBC-ն ունի առանձնահատուկ իմունային միկրոմիջավայր, որը ներառում է անոթային էնդոթելային աճի գործոնների, ուռուցքի հետ կապված մակրոֆագերի (TAM), ուռուցք ներթափանցող լիմֆոցիտների (TIL) և ուռուցքի աճի և միգրացիայի մեջ ներգրավված այլ մոլեկուլների բարձր մակարդակներ: Հետևաբար, TNBC-ի միկրոմիջավայրի հասկացողությունը կարևոր է դրա կանխատեսման և բուժման համար (Fan and He, 2022):
ՏՆԿՀ-ի կանխատեսումը գնահատելու և արդյունավետ բուժում ապահովելու համար կարևոր է ճշգրիտ ախտորոշումը, որը հիմնականում հիմնված է իմունահյուսվածաքիմիայի (IHC) վրա՝ ER, PR և HER2 հայտնաբերելու համար, և մամոգրաֆիայի վրա՝ կրծքագեղձի նորագոյացությունները հայտնաբերելու համար: Այնուամենայնիվ, մամոգրաֆիան չի կարող բավարար կերպով պատկերել ուռուցքի ներսում առկա առանձնահատկությունները, ինչպիսիք են նեկրոզը և ֆիբրոզը (Deepak Singh et al., 2021): Քանի որ վատ կանխատեսումը և ախտորոշումը խանգարում են բժիշկներին նշանակել ճիշտ դեղամիջոցներ (Chaudhary, 2020), ՏՆԿՀ-ով հիվանդների խնամքը բարելավելու համար օգտագործվում են տարբեր ռազմավարություններ: Ներկայումս ՏՆԿՀ-ով հիվանդների մոտ օգտագործվում են երկու դեղամիջոց՝ դոքսորուբիցինը և ցիկլոֆոսֆամիդը, և ցույց են տվել լավ արդյունքներ: Բացի այդ, օգտագործվում են նաև այլ պլատինային դեղամիջոցներ, ինչպիսիք են կարբոպլատինը և ցիսպլատինը (Sikov et al., 2015): Բացի այդ, ՏՆԿՀ-ի բուժման համար որպես պոտենցիալ քիմիաթերապևտիկ դեղամիջոցներ օգտագործվել են PARP ինհիբիտորներ, ինչպիսիք են Օլապարիբը, Վելապարիբը և PF-01367338-ը (Ishino et al., 2018): Քանի որ Wnt/b-Catenin, NOTCH և Hedgehog ազդանշանային ուղիները, ինչպես հաղորդվել է, ներգրավված են TNBC-ի առաջացման և զարգացման մեջ, այդ ուղիներին դեղերի թիրախավորումը կարող է կարևոր ռազմավարություն լինել (Aysola et al., 2013): Չնայած վիրահատությունը, ճառագայթային թերապիան և քիմիաթերապիան այսօր մնում են TNBC-ի բուժման հիմնական մեթոդները, զգալի առաջընթաց է գրանցվել նոր բուժումների մշակման գործում, ներառյալ թիրախային թերապիան, իմունաթերապիան, CRISPR-ի հետ կապված տարբեր գեների խմբագրման գործիքներ, ինչպիսիք են Cas9n-ը, dCas9-ը, CRISPR/Cas12-ը, prime editing-ը և CRISPR/Cas9-ի հետ կապված գենային թերապիան: Այստեղ մենք կկենտրոնանանք TNBC-ի բուժման մեջ օգտագործվող CRISPR-ի հետ կապված տարբեր գեների խմբագրման գործիքների վրա: Դրանցից CRISPR/Cas9-ը լայն ուշադրության է արժանացել:
Cas9n-ը, որը հայտնի է նաև որպես Cas9 նիկազ, Cas9 սպիտակուցի գենետիկորեն մոդիֆիկացված տարբերակ է, որը ստացվել է CRISPR/Cas9 գենոմի խմբագրման համակարգից (Gupta et al., 2019): Իր սկզբնական տեսքով Cas9 սպիտակուցը պարունակում է երկու նուկլեազային դոմեն՝ RuvC և HNH, որոնց հիմնական գործառույթը ԴՆԹ-ի երկու շղթաների կտրումն է: Սակայն Cas9n-ում նուկլեազային դոմեններից մեկը՝ HNH-ը, գենետիկորեն մուտացիայի է ենթարկվում և դառնում է ոչ ակտիվ: Հետևաբար, Cas9n-ի HNH դոմենը մնում է ոչ ֆունկցիոնալ: Միայն RuvC դոմենն է մնում ակտիվ, ինչը թույլ է տալիս Cas9n-ին կտրել կամ ստեղծել կոտրվածքներ ԴՆԹ-ի միաշղթաների վրա (Trevino and Zhang, 2014): Cas9-ի համեմատ, Cas9n-ը կարող է արդյունավետորեն նվազեցնել թիրախից շեղված ազդեցությունները և ճշգրիտ բարելավել բջիջների վերականգնման մեխանիզմները: Cas9n-ը կարող է օգտագործվել տարբեր խնդիրներ լուծելու համար, ինչպիսիք են կրկնակի շղթա ԴՆԹ-ի որոշակի տեղերում կոտրվածքներ ստեղծելը: Այս նպատակով երկու Cas9n մոլեկուլներ միավորվել և օգտագործվել են միասին (Yee, 2016): Խառը տոհմային կինազ 3-ը (MLK3) միտոգենով ակտիվացված սպիտակուցային կինազ է, որը ծառայում է որպես հիմնական կարգավորիչ TNBC մետաստազի ժամանակ (Cronan et al., 2012):
MLK3-ը կարող է ակտիվացնել բազմաթիվ ազդանշանային ուղիներ, որոնք հանգեցնում են TNBC մետաստազի: Օրինակ, c-Jun N-ծայրային կինազի (JNK) ուղին կարգավորում է բջիջների շարժունակությունը և արտաբջջային մատրիցի քայքայումը, իսկ MLK3-ը ակտիվացնում է JNK ուղին՝ դրանով իսկ ուժեղացնելով բջիջների շարժունակությունը և հաղորդելով ինվազիվ հատկություններ (Rattanasinchai and Gallo, 2016): MLK3-ը նաև կարգավորում է EMT-ն: Դրա համար այն ակտիվացնում է ներքևի տրանսկրիպցիոն գործոնները, ինչպիսիք են Snail-ը, Slug-ը և Twist-ը: Այս գործոնները կանխում են էպիթելային մարկերների արտահայտությունը և խթանում մեզենքիմալ մարկերների արտահայտությունը, ինչը հանգեցնում է մետաստատիկ ֆենոտիպի ձեռքբերմանը (Casalino et al., 2023): Նկատվել է, որ MLK3-ը դեր է խաղում ECM-ի վերակառուցման և պրոտեազների, ինչպիսիք են մատրիցային մետաղոպրոտեինազները (MMP), ակտիվացման մեջ, որոնք քայքայում են ECM-ը: Սա նպաստում է ուռուցքային բջիջների ներխուժմանը և տարածմանը հեռավոր վայրեր (Katari et al., 2019): Այսպիսով, նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ MLK3-ը կարևոր դեր է խաղում TNBC-ում: Ռատտանասինչայը և Գալլոն օգտագործել են TNBC մոդելներ՝ MLK3-ի դերը ուսումնասիրելու համար և պարզել, որ այն խթանում է քաղցկեղի զարգացումը որոշակի ազդանշանային ուղիների միջոցով: Նրանք օգտագործել են CRISPR/Cas9n՝ MLK3-ը խմբագրելու համար և նկատել են TNBC մետաստազների զգալի նվազում (Rattanasinchai and Gallo, 2016):
dCas9-ը, որը հաճախ անվանում են ոչ ակտիվ Cas9, Cas9 սպիտակուցի մոդիֆիկացված ածանցյալ ձև է: Ակտիվ Cas9-ից տարբերվող dCas9-ը չունի էնդոնուկլեազային ակտիվություն, ինչը այն դարձնում է անընդունակ ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթաների խզումներ առաջացնելու համար: Հետևաբար, dCas9-ը կարող է օգտագործվել գենոմի որոշակի շրջաններ ճշգրիտ թիրախավորելու համար՝ առանց ԴՆԹ հաջորդականության որևէ փոփոխության կամ ձևափոխության (Wang et al., 2016): dCas9-ում երկու էնդոնուկլեազային սպիտակուցներ՝ RuvC-ն և HNH-ն, ինակտիվանում են՝ ճնշելով կարևոր ամինաթթվային մնացորդները (Richter et al., 2016): Չնայած ԴՆԹ-ի քայքայման ակտիվության բացակայությանը, dCas9-ը մի շարք կարևոր դերեր է խաղում գենետիկական հետազոտություններում և կենսատեխնոլոգիայում: Օրինակ, այն թույլ է տալիս վիզուալիզացնել գենոմի որոշակի շրջաններ, հեշտացնում է տրանսկրիպցիոն կարգավորումը և խթանում էպիգենետիկ փոփոխությունները (Brocken et al., 2018):
ZEB1 տրանսկրիպցիոն գործոնը (ցինկի մատի E-box կապող հոմեոբոքս 1) խաղում է առանձնահատուկ և կարևոր դեր էպիթելային-մեզենքիմալ անցման (EMT) միջնորդման գործում, որը բջջային գործընթաց է, որը տեղի է ունենում սաղմնային զարգացման, հյուսվածքների վերականգնման և քաղցկեղի առաջընթացի ընթացքում: Այն ներառում է էպիթելային բջիջների փոխակերպումը մեզենքիմալ բջիջների, ինչը հանգեցնում է բջիջների ձևաբանության, շարժունակության, ինվազիվության և այլնի փոփոխությունների (Wu et al., 2020): ZEB1-ը արգելակում է բազմաթիվ էպիթելային մարկերներ, ինչպիսիք են E-cadherin-ը և Occludin-ը, որոնք պատասխանատու են TNBC-ում էպիթելային բջիջների բջիջների ադհեզիայի և բևեռականության պահպանման համար (Moreno-Bueno et al., 2008): Բացի այդ, ZEB1-ը ակտիվացնում է որոշակի մարկերներ, ինչպիսիք են N-cadherin-ը, վիմենտինը և ֆիբրոնեկտինը (Konradi et al., 2014), ինչպես նաև կարգավորում է ցիտոկմախքի վերակառուցման մեջ ներգրավված գեները, ինչպիսիք են Rho GTPases-ը և մատրիցային մետաղոպրոտեինազները (MMPs) (Huang): և այլք, 2014). 2022), բացի այդ, այն նաև ազդում է տարբեր ազդանշանային ուղիների վրա, ինչպիսիք են տրանսֆորմացնող աճի գործոն-β-ն (TGF-β), Wnt ազդանշանային ուղին և այլն, դրանով իսկ նպաստելով ուռուցքի ներխուժմանը և մետաստազավորմանը TNBC-ում (Chen et al., 2016): Բազմաթիվ ուսումնասիրություններ և գիտական ​​​​ապացույցներ ցույց են տալիս, որ ZEB1-ը մեծ ներուժ ունի որպես արժեքավոր գործակալ TNBC-ի հայտնաբերման և թերապևտիկ միջամտության համար: Վերջերս կատարված ուսումնասիրության մեջ Վարյան և այլք օգտագործել են TNBC մոդել և հասել ZEB1-ի լիակատար ճնշմանը dCas9-ի միջոցով: Այսպիսով, նրանք դիտարկել են ZEB1-ի շատ բարձր յուրահատկություն և գրեթե լիակատար արգելակում in vivo պայմաններում (Waryah et al., 2023):
CRISPR/Cas12-ը գեների խմբագրման գործիք է, որը կոչվում է CRISPR/Cpf1: Այն ծագել է CRISPR/Cas համակարգից, որտեղ Cas12 տերմինը վերաբերում է CRISPR-ի հետ կապված սպիտակուց 12-ին (Bharathkumar et al., 2022), որը լիովին նման է Cas9-ին: Միակ տարբերությունն այն է, որ այն պարունակում է Cas12 սպիտակուց: Cas9-ի համեմատ, Cas12-ն ունի որոշ եզակի գործառույթներ, ինչպիսիք են գեների խմբագրման գործընթացում կպչուն ծայրերի առաջացումը, մինչդեռ Cas9-ը առաջացնում է բութ ծայրեր (Wang et al., 2021): Cas12-ի այս հատկությունը նպաստում է ԴՆԹ-ի մանիպուլյացիայի յուրահատուկ տեխնոլոգիային: Որպես թիրախային ԴՆԹ-ն ճշգրիտ ճանաչելու և կտրելու ունակ սպիտակուց, այն ունի արտակարգ բազմակողմանիություն, ինչը այն դարձնում է արդյունավետ գործիք տարբեր կիրառությունների համար, ներառյալ գեների խմբագրումը (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019):
Նման CRISPR-ի այլ տարբերակներին, CRISPR/Cas12-ը նույնպես կարող է անջատել կամ ակտիվացնել TNBC-ի գեները՝ թիրախավորելով այն գեները, որոնք կարևոր դեր են խաղում դրա ախտածագման կամ բուժման նկատմամբ արձագանքի մեջ (Yang and Zhang, 2023): Այս գործընթացն իրականացնելու համար մշակվել է ուղեցույց ՌՆԹ (gRNA), որը Cas12-ը ուղղորդում է դեպի թիրախային գենը: Երբ Cas12-ը կապվում է իր թիրախին, այն ԴՆԹ-ում առաջացնում է կրկնակի շղթայական խզումներ և ակտիվացնում ԴՆԹ-ի վերականգնման մեխանիզմները: Վերականգնման գործընթացի ընթացքում կարող են ներառվել սխալ նուկլեոտիդներ, ինչը հանգեցնում է գեների մուտացիաների և ֆունկցիայի կորստի (Zhang et al., 2021a): Բացի այդ, Cas12 ֆերմենտի բարելավված տարբերակը (անվանում dCas12) նույնպես օգտագործվել է գեների ակտիվացման համար: Այն տրանսկրիպցիոն ակտիվատորի հետ համատեղելով՝ հնարավոր է ինդուկցել որոշակի գեներ, այդպիսով ակտիվացնելով դրանք: Այս տեխնոլոգիան մեծ ներուժ ունի ուռուցքը ճնշող գեների ակտիվացումը խթանելու գործում (Sultan et al., 2022):
Պրայմերի խմբագրումը գենոմի խմբագրման նոր մշակված և չափազանց գերազանց տեխնոլոգիա է: Այն ունակ է շատ ճշգրիտ փոփոխել օրգանիզմի ԴՆԹ-ն (Chen and Liu, 2023): Պրայմերի խմբագրումն իրականացվում է երկու հիմնական բաղադրիչների՝ մոդիֆիկացված CRISPR/Cas9 ֆերմենտի և հակադարձ տրանսկրիպտազի ինտեգրման միջոցով: CRISPR/Cas9 ֆերմենտի դերը գենոմի ճշգրիտ տեղամասերը ընտրողաբար թիրախավորելն է, մինչդեռ հակադարձ տրանսկրիպտազը օգնում է մանրակրկիտ փոփոխել ԴՆԹ-ն թիրախային տեղամասում (Hassan et al., 2021): Պրայմերի խմբագրման մեխանիզմում առաջին քայլը ներառում է պրայմերի խմբագրման ուղեցույց ՌՆԹ-ի (pegRNA) ստեղծումը (Standage-Beier et al., 2021): Այն պարունակում է թիրախային ԴՆԹ-ում ցանկալի խմբագրման տեղամասին համապատասխանող թիրախային հաջորդականությունը և ՌՆԹ-ի ձևանմուշը: Այնուհետև pegRNA-ն ներմուծվում է թիրախային բջիջների մեջ՝ պրայմերի խմբագրման նուկլեազի (PE2) հետ միասին: PE2-ը միաձուլված սպիտակուց է, որը բաղկացած է Cas9 ֆերմենտից, հակադարձ տրանսկրիպտազից և պրայմերի խմբագրման ադապտերից (Martín-Alonso et al., 2021): Բջջի ներսում pegRNA և PE2 համալիրները փնտրում են այն կոնկրետ ԴՆԹ-ն, որը ցանկանում են փոփոխել: Cas9 ֆերմենտը կտրում է ԴՆԹ-ն և ստեղծում է միաշղթաներից բաղկացած ձևանմուշ (Choi et al., 2022): Հակադարձ տրանսկրիպտազը օգտագործում է այս ձևանմուշը՝ ԴՆԹ-ն խմբագրման համար պատրաստելու համար: ԴՆԹ-ի պատճենահանման հետ մեկտեղ ներառված են նաև ՌՆԹ ձևանմուշը խմբագրելու հրահանգներ: Վերջապես, նոր ստեղծված ԴՆԹ շղթան օգտագործվում է որպես ձևանմուշ՝ ԴՆԹ-ի կոտրվածքը վերականգնելու համար, որի արդյունքում ստեղծվում է փոփոխված ԴՆԹ հաջորդականություն, որը պարունակում է ցանկալի փոփոխությունը (Ochoa-Sanchez et al., 2021): Պրայմերային խմբագրման մեխանիզմները կարող են հանգեցնել գեների լայնածավալ մուտացիաների: Այն կարող է թիրախավորել կետային մուտացիաները, ինսերցիաները, ջնջումները և նույնիսկ գեների փոխարինումները (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023): Պրայմերային խմբագրումն առաջարկում է մի շարք առավելություններ գենոմի խմբագրման նախորդ տեխնոլոգիաների համեմատ: Դրանք ներառում են ճշգրտության բարձրացում, թիրախից շեղված էֆեկտների նվազում և ԴՆԹ-ն խմբագրելու հնարավորություն՝ առանց ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթա կոտրվածքների վրա հույս դնելու (Anzalone et al., 2020):
CRISPR/Cas9 տեխնոլոգիան սկզբնապես մշակվել է բակտերիաները պլազմիդային փոխանցումից և ֆագային վարակից պաշտպանելու համար, իսկ ավելի ուշ վերաօգտագործվել է որպես գենոմի խմբագրման համար արդյունավետ ՌՆԹ-ի վրա հիմնված ԴՆԹ թիրախավորման գործիք (Jiang and Doudna, 2017): Բացի այդ, CRISPR/Cas9 համակարգը, ըստ հաղորդումների, առկա է բակտերիալ և արխեական գենոմների համապատասխանաբար 50%-ում և 87%-ում (Ishino et al., 2018): CRISPR/Cas9-ը պոտենցիալ գործիք է ցանկացած աննորմալ գենետիկական հաջորդականության հեռացման, ներդրման և ուղղման համար՝ օգտագործելով in vivo և in vitro ռեժիմները (Sabit et al., 2021): Ավելին, CRISPR/Cas9-ը, ինչպես ցույց է տրվել, ադապտիվ իմունային համակարգի մաս է կազմում՝ հետաքրքրության թիրախային գեների նկատմամբ իր յուրահատկության շնորհիվ (Chen and Zhang, 2018):
CRISPR/Cas9-ը բաղկացած է Cas9-ից և մեկ ուղեցույց ՌՆԹ-ից (sgRNA): Cas9-ը էնդոնուկլեազ է, որը կազմված է բազմաթիվ սպիտակուցային բաղադրիչներից: Բացի այդ, Cas9-ը ունի եզակի կառուցվածքային և կոնֆորմացիոն հատկություններ (Pacesa et al., 2022), քանի որ այն բաղկացած է երկու բլթակից՝ ճանաչման (REC) և նուկլեազի (NUC): REC բլթը հետագայում բաժանվում է երեք շրջանների՝ REC1, REC2 և կամրջային պարույրներ (Cromwell et al., 2018): NUC-ն բաղկացած է երեք բլթակից՝ RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH և պրոտոտարածիչի հարակից մոտիվի (PAM) փոխազդեցության տիրույթ (Նկար 1) (Song et al., 2016): sgRNA-ն բաղկացած է երկու բաղադրիչներից՝ ներառյալ CRISPR ՌՆԹ-ն (crRNA) և տրանսկոդավորող փոքր ՌՆԹ-ն (հետքիչ ՌՆԹ) (Նկար 1): sgRNA-ն կապում է Cas9 սպիտակուցը կոնեքսինների հետ՝ առաջացնելով ակտիվ համալիր, որը հայտնի է նաև որպես էֆեկտորային համալիր (Richter et al., 2012): crRNA-ն 18-20 նուկլեոտիդային հիմքերի զույգ է, որը կարևոր դեր է խաղում թիրախային ԴՆԹ հաջորդականությունները ճանաչելու գործում: Բացի այդ, crRNA-ն զույգ է կազմում թիրախային ԴՆԹ-ի հետ, և tracrRNA-ն գործում է որպես կառամատույց Cas9 նուկլեազի համար՝ թիրախային ԴՆԹ-ին կապվելու համար (Manghwar et al., 2019): Մյուս կողմից, PAM հաջորդականությունն ունի 3 նուկլեոտիդ, որը հաստատում, ճշգրտում և միջնորդում է էֆեկտորային համալիրի կապը ԴՆԹ-ի հետ: Cas9 սպիտակուցային համալիրի RuvC և HNH ենթամիավորներն ունեն կատալիտիկ ակտիվություն (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021): Cas9 ենթամիավորի HNH նուկլեազային տիրույթը կտրում է crRNA-ի հետ կապված ԴՆԹ շղթան: RuvC նուկլեազային տիրույթը կտրում է ԴՆԹ-ի մյուս շղթաները և առաջացնում կրկնակի շղթայական կտրվածքներ (DSB), որից հետո ակտիվանում են ԴՆԹ-ի կտրվածքի վերականգնման երկու տարբեր մեխանիզմներ (Jiang and Doudna, 2017) (Նկար 1):
Նկար 1. CRISPR/Cas9-ի ակնարկ (A): CRISPR/Cas9 համակարգի բաղադրիչները՝ (i). Cas9 էնդոնուկլեազը պատասխանատու է թիրախային ԴՆԹ հաջորդականության կտրման համար, (ii) crRNA-ի և tra-crRNA քիմերաների միաձուլումից առաջացող միակ ուղեցույց (sg) ՌՆԹ-ի համար: (երկու): Cas9-ը ներառում է մի քանի բաղադրիչներ, ինչպիսիք են Rec I-ն, Rec II-ը, NUC բլթը (HNH-ն և Ruv C-ն ենթաբաղադրիչներ են) և PAM փոխազդեցության տիրույթը (C)՝ համապատասխան գործառույթներով: CRISPR/Cas9 սպիտակուցային համալիրը ԴՆԹ հաջորդականությունները կտրում է ոչ լրացուցիչ և լրացուցիչ ձևերի (D): CRISPR/Cas9-ը խմբագրում է գենոմը երեք փուլով՝ ճանաչում, կտրում և վերականգնում: Նախագծված sg-ՌՆԹ-ն ուղղորդում է Cas9-ին և ճանաչում է ցանկալի հաջորդականությունը լրացուցիչ բաղադրիչ crRNA-ի միջոցով: Cas9-ը ճանաչում է PAM հաջորդականությունը 5′-NGG-3′-ում և հալեցնում ԴՆԹ-ն՝ ձևավորելով ԴՆԹ-ՌՆԹ հիբրիդ և ակտիվացնելով կտրումը: Cas9-ի HNH տիրույթը կտրում է լրացուցիչ շղթան, իսկ RuvC տիրույթը՝ ոչ լրացուցիչ շղթան։ CRISPR/Cas9-ը վերականգնում է dsDNA-ն՝ այն կտրելով երկու եղանակով՝ ոչ հոմոլոգ ծայրերի միացում (NHEJ) և հոմոլոգիա-ուղղորդված վերականգնում (HDR): NHEJ-ը վերականգնում է երկշղթա ԴՆԹ-ն օտար հոմոլոգ ԴՆԹ-ի բացակայության դեպքում՝ ֆերմենտատիվ գործընթացի միջոցով, որը սխալների հակված մեխանիզմ է, որը կարող է ներմուծել կամ հեռացնել պատահական ԴՆԹ հաջորդականություններ: HDR-ն շատ սպեցիֆիկ է և պահանջում է հոմոլոգ ԴՆԹ-ի կաղապարներ։
CRISPR/Cas9-միջնորդավորված վերականգնման ուղիները ներառում են ոչ հոմոլոգ ծայրերի միացման (NHEJ) և հոմոլոգիա-ուղղորդված վերականգնման (HDR) մեխանիզմներ: NHEJ-ը սխալների հակված ուղի է, քանի որ այն ներառում է ներմուծում կամ ջնջում և վերականգնման մեխանիզմի ընթացքում որևէ օրինաչափություն չի պահանջում: Այն օգտագործում է պատահական նուկլեոտիդներ՝ ստանդարտ սպիտակուցներ ստեղծելու համար (Abbasi et al., 2021): Այս վերականգնման համակարգը բաղկացած է չորս համալիրներից, ինչպիսիք են KU համալիրը, խաչաձև լրացվող սպիտակուցային համալիրը 4-րդ տիպի (XRCC-4), ԴՆԹ ծայրերի մշակման ֆերմենտը և սպիտակուցային կինազ DNA-PKcs-ը (Abbasi et al., 2021): KU համալիր սպիտակուցն ունի երկու ենթամիավոր՝ Ku 70 և Ku 80, և կարևոր դեր է խաղում NHEJ մեխանիզմում, քանի որ վերականգնման մեխանիզմը սկսվում է երկու ենթամիավորների (Ku 70 և Ku 80) կապմամբ թիրախային ԴՆԹ-ի բութ կամ գրեթե բութ ծայրերին (Abbasi et al., 2021), որոնք ծառայում են որպես հիմք վնասվածքի տեղամաս այլ NHEJ-ի հետ կապված գործոններ ներգրավելու համար (Yang et al., 2020): XRCC-4-ը և ԴՆԹ լիգազը կազմված են համապատասխանաբար 334 և 911 ամինաթթուներից, իսկ XRCC4-ԴՆԹ լիգազ IV համալիրը խթանում է ԴՆԹ ծայրերի կապումը (Chatterjee et al., 2015): ԴՆԹ ծայրերի մշակման ֆերմենտը, որը հայտնի է նաև որպես պոլինուկլեոտիդ կինազ 3'-ֆոսֆատ, ԴՆԹ ծայրերի մշակման ֆերմենտ է: Այն կարող է հեռացնել ԴՆԹ-ի 3'P խումբը և ֆոսֆորիլացնել 5'OH խումբը DSB վերականգնման ընթացքում: Այն նաև ներառում է միաշղթա կոտրվածքների (SSB) վերականգնումը՝ օգտագործելով SSB վերականգնման ուղին (Chatterjee et al., 2015): Սպիտակուցային կինազ DNA-PKcs-ը ԴՆԹ-կախյալ սպիտակուցային կինազ է, որը բաղկացած է PIKKs (ֆոսֆատիդիլինոզիտոլ 3-կինազ-կապակցված կինազներ) և ataxia telangiectasia mutated (ATM) ընտանիքի կատալիտիկ ենթամիավորից, ինչպես նաև ATM և Rad3-կապակցված ATR-ներից, շղթայական կոտրվածքներից (DSB) և միաշղթա կոտրվածքներից (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016):
HDR-ն ավելի ճշգրիտ և հարմար վերականգնման մեխանիզմ է, քանի որ տեղեկատվությունը պատճենվում է հոմոլոգ ԴՆԹ դուպլեքսի ամբողջական ձևի միջոցով, չնայած դա պահանջում է քույր քրոմատիդների առկայություն: Սա տեղի է ունենում կաթնասունների բջջային ցիկլի S/G2 փուլում: HDR-ն հիմնականում տեղի է ունենում խմորիչների տեսակների մոտ, բայց NHEJ-ը կարևոր է կաթնասունների մոտ (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021): Վերականգնման ամբողջական մեխանիզմը ներկայացված է նկար 1-ում:
Քանի որ TNBC-ն առաջանում է գենետիկական և էպիգենետիկ անոմալիաների պատճառով, չարորակ գենոմային/էպիգենոմային անոմալիաների շտկումը CRISPR/Cas9-ի միջոցով կարող է լինել ողջամիտ թերապևտիկ մոտեցում (Chen et al., 2019): Բացի այդ, բջջային տրանսկրիպցիոն կարգավորման մեջ ներգրավված որոշ տրանսկրիպցիոն գործոններ կարող են ցուցաբերել քաղցկեղի բջիջների եզակի բնութագրեր, ինչը ենթադրում է, որ տրանսկրիպցիոն կարգավորումը կարող է լինել քաղցկեղի բուժման գերազանց մոտեցում (Drost et al., 2017): Ուռուցքների այս մոլեկուլային առանձնահատկությունների, ինչպիսիք են գենետիկական, էպիգենետիկ և տրանսկրիպցիոն արատները, օգտագործումը դեղերի մշակման համար կարող է բարելավել կլինիկական արդյունքները և նվազեցնել սկրինինգի ծախսերը: CRISPR-ը գեների խմբագրման պոտենցիալ գործիք է, որը կարող է ոչ միայն հայտնաբերել և նույնականացնել քաղցկեղ առաջացնող գենոմային թիրախները, այլև կարող է օգտագործվել մարդու բջիջներում ուռուցքագենները խմբագրելու, ճնշելու և էպիգենետիկորեն փոփոխելու համար (աղյուսակ 1) (Ahmed et al., 2021): CRISPR-ի մի քանի սկրինինգներ են անցկացվել ուռուցքի ճնշիչների, ուռուցքագենների և դեղերի նկատմամբ դիմադրության հետ կապված գեները որոնելու համար: CRISPR/Cas9-ի կիրառումը տարբեր TNBC ուռուցքածին գեների խմբագրման համար ներկայացված է նկար 2-ում։
Նկար 2. Տարբեր TNBC ուռուցքագոյացությունների գեների խմբագրում՝ CRISPR/Cas9-ի միջոցով, որը հանգեցնում է ուռուցքի աճի և մետաստազի նվազմանը: Այս ուռուցքագոյացությունների թվում են CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 և CXCR7, Crypto1, ROR1 և ST8SIA, որոնք ներգրավված են TNBC-ի առաջացման և մետաստազի մեջ:
Քաղցկեղի բջիջների միգրացիան, ներխուժումը և էպիթելային-մեզենքիմալ անցումը (ԷՄՏ) կապված են ITGA9-ի հետ: Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ITGA9-ը Notch ուղու հիմնական դերակատարներից է և հետաքրքիր դեր է խաղում ռաբդոմիոսարկոմայի մետաստազավորման մեջ (Molist et al., 2020): Բացի այդ, պարզվել է, որ ITGA9-ը սերտորեն կապված է մի քանի տեսակի ուռուցքների, այդ թվում՝ կրծքագեղձի քաղցկեղի հիվանդների կանխատեսման հետ (Wang Z. et al., 2019): Բացի այդ, ITGA9-ի կենսաինֆորմատիկ վերլուծությունը ցույց է տվել, որ դրա արտահայտությունը TNBC-ում զգալիորեն ավելի բարձր էր, քան կրծքագեղձի քաղցկեղի այլ ենթատիպերում: ITGA9-ի բարձր մակարդակը կապված է ուռուցքի մետաստազի և կրկնության հետ TNBC հիվանդների մոտ: ITGA9-ի նոկաուտը CRISPR/Cas9-ի միջոցով հանգեցրել է քաղցկեղի ցողունային բջիջների (CSC) նման հատկությունների, ուռուցքի անգիոգենեզի, ուռուցքի աճի և մետաստազների նվազման՝ TNBC-ում β-կատենինի քայքայման խթանման միջոցով (Wang Z. et al., 2019):
Crypto-1-ը TGF-β ընտանիքի անդամ է և կարևոր է վաղ էմբրիոգենեզի, ցողունային բջիջների պահպանման և քաղցկեղի մետաստազի համար (Ishii et al., 2021): Հայտնի է նաև որպես Tdgf-1, այն ուռուցքածին GPI-խարսխված ազդանշանային սպիտակուց է, որը մասնակցում է պարզունակ շերտի, մեզոդերմի և էնդոդերմի ձևավորման կարգավորմանը, ինչպես նաև մարմնի օրգանների զարգացման մեջ ձախ/աջ ասիմետրիայի հաստատմանը էմբրիոգենեզի ընթացքում (Zhang et al., 2021b): Բացի այդ, ցույց է տրվել, որ Cripto-1-ը մասնակցում է էպիթելային-մեզենքիմալ անցմանը (EMT) որպես ցողունային բջիջների մարկեր (Zhang et al., 2021b): EMT-ն կարևոր է ոչ միայն տարբեր գործընթացների համար, ինչպիսիք են էմբրիոնալ զարգացումը, ֆիբրոզը և վերքերի բուժումը, այլև քաղցկեղի ներխուժման և մետաստազի համար: Բացի այդ, ցույց է տրվել, որ Cripto-1-ը փոխազդում է չորս Notch ընկալիչների հետ և ուժեղացնում դրանց հետթրանսլյացիոն հասունացումը (Brandstadter and Maillard, 2019): Notch ազդանշանային ուղին հայտնի է նրանով, որ մասնակցում է մարդու կրծքագեղձի քաղցկեղի բջիջների պահպանմանը: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ CRISPR/Cas9-ի միջոցով Crypto-1-ի նոկաուտը ճնշում է քաղցկեղի աճը և մետաստազը: Հետևաբար, Crypto-1-ը կարող է դառնալ կարևոր թերապևտիկ թիրախ կրծքագեղձի քաղցկեղի համար (Castro et al., 2015):
XCL12 սպիտակուցը և դրա քեմոկինային ընկալիչ CXC-ն (CXCR4 և CXCR7) տարբեր դեր են խաղում քաղցկեղի բջիջների բազմացման, աճի, միգրացիայի և ներխուժման մեջ (Wu et al., 2015): Այս քեմոռեցեպտորները կապված են եղել TNBC-ի զարգացման հետ՝ բազմաթիվ ազդանշանային ուղիների միջոցով՝ թե՛ in vivo, թե՛ in vitro մոդելներում (Wu et al., 2015): Բացի այդ, CXCR4-ի և CXCR7-ի ակտիվացումը կապված է TNBC-ի մետաստազների նկատմամբ ավելի մեծ զգայունության և վատ կանխատեսման հետ (Karn et al., 2022): Հետևաբար, CXCR4-ի և CXCR7-ի նոկաուտը կարող է դառնալ արդյունավետ դեղամիջոցի թիրախային գեներ կրծքագեղձի քաղցկեղի, այդ թվում՝ TNBC-ի բուժման համար: Յանգի և այլոց կողմից անցկացված ուսումնասիրությունը: Յանգը և այլք (2019) օգտագործել են CRISPR/Cas9-ը՝ CXCR4 և CXCR7 գեները համատեղ նոկաուտելու համար և պարզել են, որ TNBC-ի բազմացումը, աճը, միգրացիան և ներխուժումը զգալիորեն արգելակվել են (Yang et al., 2019):
Կրծքագեղձի քաղցկեղի հյուսվածքներում դիտվել է miR-3662-ի՝ TNBC ուռուցքագոյացման գենի, բարձր մակարդակ (Yi et al., 2022): Ցույց է տրվել, որ miR-3662-ի նոկդաունը կանխում է կրծքագեղձի քաղցկեղի ուռուցքի աճը և մետաստազավորումը ինչպես in vivo, այնպես էլ in vitro պայմաններում (Agarwal and Gupta, 2021): HBP-1-ը Wnt/-կատենին ազդանշանային ուղու հզոր արգելակիչ է և, հավանաբար, պատասխանատու է TNBC բջիջների miR-3662-միջնորդավորված աճի համար: Վերջերս Յին և այլք պարզել են, որ miR-3662-HBP1 առանցքը կարգավորում է Wnt/-կատենին ազդանշանային ուղին TNBC բջիջներում (Yi et al., 2022): Իր ուռուցք-սպեցիֆիկ արտահայտման շնորհիվ miR-3662-ը կարող է լինել TNBC-ի համար պոտենցիալ թերապևտիկ թիրախ: Այսպիսով, CRISPR/Cas9-միջնորդավորված miR-3662-ի նոկդաունը կարող է լինել TNBC-ի բուժման համար նոր դեղամիջոցներ մշակելու գերազանց մոտեցում:
UBR5-ը 300 կԴա նուկլեոֆոսֆոպրոտեին է, որը ճանաչվել է որպես ուռուցքագոյացման, մետաստազի և տարբեր քաղցկեղների իմունային պատասխանի հիմնական կարգավորիչ (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023): Հաղորդվել է, որ UBR5-ը բարձր ակտիվություն ունի TNBC նմուշներում և խթանում է ERα ֆունկցիան՝ իր ուբիկվիտին լիգազային ակտիվության միջոցով առաջացնելով պրոլիֆերացիա (Bolt et al., 2015): Առաջնային TNBC նմուշների ամբողջական էկզոմի հաջորդականության ուսումնասիրությունները նույնպես ցույց են տվել UBR5-ի արտահայտման աճ, ինչը ենթադրում է դրա դերը TNBC-ի զարգացման մեջ: Բացի այդ, CRISPR/Cas9-ի կողմից առաջացած UBR5-ի ջնջումը ցույց է տվել TNBC մետաստազի և աճի զգալի արգելակում փորձարարական մկների մոդելներում: Ավելին, UBR5-ի ներառումը վայրի տիպի մկան մոդելում վերականգնել է դրա լիարժեք ֆունկցիոնալությունը, մինչդեռ այս ազդեցությունը չի նկատվել ինակտիվացված մուտանտ շտամներում (Liao et al., 2017): UBR5-ի բացակայությունը կապված է ապոպտոզի, նեկրոզի և ուռուցքի աճի արգելակման աճի հետ՝ տրանսկրիպցիա 1-ի (STAT1) վատ զարգացման պատճառով։ UBR5-ի կորստի պատճառով ուռուցքի տարածումը հեռավոր օրգաններ նվազում է, և UBR5-ը առաջացնում է աննորմալ EMT՝ հիմնականում նվազեցնելով E-կադհերինի արտահայտությունը (Zhang and Weinberg, 2018): Վերջերս ցույց է տրվել, որ UBR5-ը շատ կարևոր գործոն է տրանսկրիպցիա 1-ի (TNBC) IFN-γ-ի կողմից ինդուկցված PDL1 տրանսկրիպցիայի մեջ՝ E3 ուբիկվիտինացման ակտիվության բացակայության պատճառով։ ՌՆԹ տրանսկրիպտոմների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ UBR5-ը կարող է համակարգային ազդեցություն ունենալ IFN-γ ուղու հետ կապված գեների վրա և խթանել PDL1 տրանսակտիվացումը՝ բարձրացնելով սպիտակուցային կինազ ՌՆԹ-ի (PKR) և դրա ազդանշանային փոխակերպիչների և ակտիվատորների ակտիվացման մակարդակը։ Տրանսկրիպցիա 1 (STAT1) և ինտերֆերոն կարգավորող գործոն 1 (IRF1): Այնուամենայնիվ, CRISPR/Cas9-ի միջնորդությամբ UBR5-ի և PD-L1 արտահայտության համակցված աբլացիան ունի ավելի սիներգետիկ թերապևտիկ ազդեցություն, քան առանձին վերցրած այս երկու բլոկադաները, ինչը խոր ազդեցություն ունի ուռուցքի միկրոմիջավայրի վրա (Wu et al., 2022): Այսպիսով, CRISPR/Cas9-ը կարող է կարևոր գործիք լինել UBR5-ի ֆունկցիան արգելակելու համար, այդպիսով ճնշելով TNBC մետաստազը և ուռուցքի աճը:
ROR1-ը I տիպի թաղանթային սպիտակուց է, որը արտահայտվում է քաղցկեղի և սաղմնային զարգացման ընթացքում և նույնականացվել է որպես օնկոֆետալ սպիտակուց (Nicholas Borcherding, 2014): Մարդու տարբեր քաղցկեղների ինվազիվ վարքագիծը կապված է ROR1-ի ակտիվացման հետ: Խոստումնալից արդյունքներ են ստացվել in vivo և in vitro ուսումնասիրություններից, որոնք ներառում են ROR1-ը թիրախավորող թերապևտիկ միացություններ (Chien et al., 2016): Կրծքագեղձի հյուսվածքների բիոպսիաներում ROR1 mRNA-ի բարձր մակարդակը կապված է նաև ագրեսիվ բազալանման կրծքագեղձի (BL) ուռուցքների և դրանց մարմնի այլ մասեր տեղափոխման հետ: Ավելին, ROR1-ի գերարտահայտումը նույնականացվել է որպես TNBC-ի զարգացման կանխատեսող մարկեր (Chien et al., 2016): Այնուամենայնիվ, ROR1-ի լռեցումը CRISPR/Cas9-ի միջոցով՝ TNBC-ի աճը և մետաստազը ճնշելու համար, կլինի արդյունավետ ռազմավարություն:
Սիալացման գործընթացը ներառում է սիալաթթվի ավելացումը գլիկոկոնյուգատներին, որը կատալիզացվում է սիալիլտրանսֆերազների (ST) կողմից: ST8SIA1-ը պատկանում է ST ընտանիքին և կարևոր դեր է խաղում տարբեր հիվանդությունների, ինչպիսիք են լիմֆոցիտային լեյկոզը և հաստ աղիքի քաղցկեղը, ախտածագման մեջ (Chang et al., 2018): ՌՆԹ հաջորդականության վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ ST8SIA1-ը բարձր է արտահայտվում կրծքագեղձի քաղցկեղով (TNBC) հիվանդների կրծքագեղձի հյուսվածքում և դրականորեն կապված է ուռուցքի ճնշող p53 գենի մուտացիաների հետ, որոնք կարող են նպաստել TNBC-ի ախտածագմանը (Battula et al., 2017): Բացի այդ, ST8SIA1-ը ներգրավված է TNBC-ի մետաստազավորման և կրկնության մեջ, ինչը ենթադրում է, որ այն կարևոր դեր է խաղում TNBC-ի առաջացման և զարգացման մեջ: TNBC-ի in vitro մոդելում CRIPSR/Cas9-ի միջոցով ST8SIA1-ի նոկդաունը կասեցրել է աճը և մետաստազավորումը (Battula et al., 2017): Սա ենթադրում է, որ CRISPR/Cas9-ը կարող է կարևոր գործիք լինել TNBC-ի բուժման մեջ ST8SIA1 ուռուցքածին գենի ֆունկցիան արգելակելու համար։
NAT1-ը նյութափոխանակության ֆերմենտ է, որը կատալիզացնում է II փուլի քսենոբիոտիկ միացությունների ձևավորումը և արտահայտվում է գրեթե բոլոր մարդու հյուսվածքներում: NAT1-ը կարող է օգտագործել կոֆակտոր ֆոլատը՝ ացետիլ-CoA-ն (ացետիլ-CoA) թիրախավորելու համար նույնիսկ արոմատիկ ամինային սուբստրատի բացակայության դեպքում (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014): Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ NAT1-ը կարգավորում է մատրիցային մետաղոպրոտեինազ 9-ի (MMP9) գործառույթը կրծքագեղձի քաղցկեղի բջջային մոդելներում և պաշտպանում է ռեակտիվ թթվածնային տեսակներից (ROS) գլյուկոզային սովի ժամանակ (Wang et al., 2018): NAT1-ի դելեցիան, ինչպես ցույց է տվել հետազոտությունը, արգելակում է պիրուվատ դեհիդրոգենազ համալիրը, ինչը հանգեցնում է միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի (Wang L. et al., 2019): Բացի այդ, տարբեր այլ զեկույցներ ցույց են տվել, որ փոքր մոլեկուլների և siRNA լռեցման միջոցով NAT1-ի արգելակումը կարող է նվազեցնել կրծքագեղձի քաղցկեղի բջիջների ինվազիվությունը և բազմացումը (Stepp et al., 2018): Վերջերս CRISPR/Cas9-ը կիրառվել է կրծքագեղձի քաղցկեղի MDA-MB-231 բջջային գծում NAT1-ը ճնշելու համար՝ ազդելով բջջային նյութափոխանակության վրա՝ կախված դրա արտահայտման մակարդակից: Այս ուսումնասիրությունը նաև ցույց է տվել, որ NAT-1-ը կարևոր է կրծքագեղձի քաղցկեղի առաջընթացի և մետաստազավորման համար (Carlisle et al., 2020):
Ուռուցքային գեների համակարգված տրանսկրիպցիան կարգավորվում է գերուժեղացուցիչներով, տրանսկրիպցիոն գործոններով և կոֆակտորներով (Hnisz et al., 2015): Բացի այդ, տրանսկրիպցիոն կարգավորման համար անհրաժեշտ են ցիկլին-կախյալ կինազների (CDK) մի խումբ, ինչպիսիք են CDK7-ը, CDK8-ը, CDK9-ը, CDK12-ը և CDK13-ը: Դրանցից CDK7-ը մասնակցում է ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի ֆոսֆորիլացմանը, որը շատ կարևոր է ուռուցքաբանական տրանսկրիպցիայի սկզբնավորման և ընդլայնման համար TNBC-ի ախտածագման մեջ: Հիմնարար ուսումնասիրության մեջ CRISPR/Cas9-ի միջոցով CDK7-ի դելեցիան արգելակել է TNBC-ն, ինչը ցույց է տալիս, որ TNBC-ի ախտածագումը կախված է CDK7-ից (Wang Y. et al., 2015):
Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ MYC-ի և RBP-ի (ՌՆԹ կապող սպիտակուց) մուտացիաները կարող են հանգեցնել ապոպտոզի, մինչդեռ MYC-ի կամ RBP-ի մեկ գենի մուտացիաները չեն ազդում քաղցկեղի բջիջների աճի վրա (Einstein et al., 2021): Մարդու գենոմի ավելի քան 1000 RBP-ներ ստուգվել են CRISPR/Cas9-ի վրա հիմնված գրադարանի միջոցով: Դրանցից 57 RBP-ներ կարևոր են եղել MYC-ի բարձր մակարդակ ունեցող քաղցկեղի բջիջների աճի համար (Wheeler et al., 2020): Բացի այդ, YTHDF2-ը կարևոր է TNBC բջիջների աճի պահպանման համար և նվազեցնում է մեթիլացված տրանսկրիպտների քանակը բարձր մակարդակի տրանսկրիպցիայի և թարգմանության ընթացքում MYC-ի ավելի բարձր արտահայտությամբ քաղցկեղի բջիջներում: Բացի այդ, YTHDF2-ը էական չէ քաղցկեղի բջիջների համար, որոնք ավելի քիչ են կախված MYC-ի բարձր մակարդակից՝ TNBC հիվանդների գոյատևումը երկարացնելու համար (Einstein et al., 2021), ինչը ենթադրում է, որ այն կարող է լինել TNBC-ն հաղթահարող դեղամիջոցների պոտենցիալ թերապևտիկ թիրախ:
Ցինկի մատների սպիտակուցները (ZNF) կազմում են մարդու ընդհանուր գենոմի մոտավորապես 1%-ը: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ZNF-ը կարող է կարգավորել բջիջների բազմացումը տարբեր քաղցկեղների դեպքում, ինչպիսիք են լյարդի քաղցկեղը, կրծքագեղձի քաղցկեղը և հաստ աղիքի քաղցկեղը (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017): CRISPR նոկաուտի միջոցով ստեղծված գրադարանները օգտագործվել են կրծքագեղձի քաղցկեղի բջիջներում տարբեր ուռուցքի ճնշող գեների (TSG) սկրինինգի համար (Shalem et al., 2014): Այդ ժամանակվանից ի վեր CRISPR/Cas9 ZNF319-ից հեռացված կրծքագեղձի քաղցկեղի բջիջների տրանսկրիպտոմիկ ուսումնասիրությունը ցույց է տվել, որ ZNF319-ը ուռուցքի ճնշող գեն է, որը նվազեցնում է կրծքագեղձի քաղցկեղի բազմացումը և, հետևաբար, ներգրավված է տարբեր պոտենցիալ ազդանշանային մեխանիզմներում և այլ կենսաբանական գործառույթներում (Wang L. et al., 2022):
Ֆերոպտոզը ծրագրավորված բջջային մահվան տեսակ է, որը կախված է երկաթի առկայությունից: Հայտնի է, որ ֆերոպտոզի զարգացումը կախված է լիպիդային պերօքսիդների առկայությունից: Բացի այդ, PKCβII-ը, ըստ հաղորդումների, ցուցաբերում է վաղ լիպիդային պերօքսիդացում, և լիպիդային պերօքսիդացման աճը կապված է ֆերոպտոզի հետ: CRISPR/Cas9-միջնորդավորված կինազային ինհիբիտորների գրադարանի սկրինինգը ցույց տվեց, որ PKCβII-ը ներգրավված է լիպիդային պերօքսիդացման գործընթացում, որը կարևոր է MDA-MB-231 բջիջներում ֆերոպտոզի համար (Zhang et al., 2022): Հետևաբար, սա ենթադրում է, որ PKCβII-ի CRISPR/Cas9-ի կողմից նոկաուտավորումը կարող է լինել ուռուցքի ճնշող գենի պոտենցիալ թիրախ ֆերոպտոզի հետ կապված հիվանդությունների բուժման համար (Zhang et al., 2022):
Դեղերի նկատմամբ կայունությունը համարվում է քաղցկեղով հիվանդների մահերի մոտ 90%-ի պատճառը և քաղցկեղի բուժման հիմնական մարտահրավերներից մեկն է (Bukowski et al., 2020): Արդյունքները ցույց են տալիս, որ դեղերի արտահոսքի, ԴՆԹ-ի վերականգնման, ապոպտոզի և բջջային ազդանշանային տարբեր ուղիների հետ կապված բավարար թվով գեներ կապված են դեղերի նկատմամբ կայունության հետ (Haider et al., 2020): Դրանց թվում են մի քանի գեներ, որոնք թիրախավորվել են CRISPR/Cas9 գործիքների կողմից և խոստումնալից արդյունքներ են ցույց տվել դեղերի նկատմամբ կայունության նվազեցման և քաղցկեղի դեմ բուժման արդյունավետության բարձրացման գործում (Vaghari-Tabari et al., 2022): Բացի այդ, բարձր արդյունավետությամբ CRISPR/Cas9 գեների նոկաուտի սկրինինգի գրադարանները ներգրավված են եղել դեղերի նկատմամբ կայունության պոտենցիալ գեների թիրախների ֆունկցիայի փոփոխման մեջ (Shalem et al., 2015): Պակլիտաքսելի նկատմամբ դիմադրության գեները նույնականացնելու համար օգտագործվել է ՌՆԹ հաջորդականացումը՝ զուգակցված գենոմի լայնածավալ sgRNA գրադարանի սկրինինգի հետ՝ ութ թեկնածու գեներ նույնականացնելու համար, այդ թվում՝ հիստոն դեացետիլազ 9-ը (HDAC9), որոնք կապված են դեղորայքային դիմադրության հետ կրկնվող TNBC ունեցող հիվանդների մոտ (B et al., 2020): Մեկ այլ ուսումնասիրության մեջ հակաքաղցկեղային դեղամիջոցներով բուժվող TNBC հիվանդների գոյատևման ընթացքում դիտվել է դիսերին/թրեոնինի և տիրոզին սպիտակուցային կինազի (DSTYK) արտահայտման աճ: Ավելին, CRISPR/Cas9-ի միջնորդությամբ DSTYK-ի նոկդաունը զգալիորեն ուժեղացրել է դեղորայքային դիմադրության քաղցկեղի բջիջների ապոպտոզը in vitro (SUM102PT բջիջներ և MDA-MB-468 բջիջներ) և in vivo TNBC մոդելում (Ogbu et al., 2021):
Չնայած TNBC-ն ունի MAPK ուղու աննորմալ ակտիվացում, MEK-նպատակային թերապիաների կլինիկական ազդեցությունը թույլ է: CRISPR/Cas9 գենոմային գրադարանի սկրինինգը ցույց տվեց, որ PSMG2-ի (պրոտեոմի հավաքման շապերոն 2) արգելակումը զգայունացնում է TNBC BT549 և MB468 բջիջները MEK արգելակիչ AZD6244-ի նկատմամբ: PSMG2-ի CRISPR/Cas9-ի նոկդաունը փոխեց պրոտեոսոմի նորմալ ֆունկցիան, ինչը հանգեցրեց PDPK1-ի աուտոֆագիայի միջնորդությամբ ապամոնտաժման, այդպիսով ավելի բարելավելով ուռուցքային բջիջները TNBC մկների մոդելներում, որոնք ինդուկցվել են AZD6244-ի (MEK արգելակիչ) և MG132-ի (պրոտեոզոմի արգելակիչ) կողմից: Այսպիսով, պրոտեոսոմի և MAP կինազի (MEK) արգելակիչները կարող են սիներգիստորեն կիրառվել ուռուցքային բջիջների բազմացումը նվազեցնելու համար (Wang X. et al., 2022):
CRISPR/Cas9-ը նաև օգտագործվել է TNBC-ի դիմադրությանը հանգեցնող գեների ֆունկցիայի կորստի սկրինինգի համար (Shu et al., 2020): Ge-ն և այլք բացատրել են JQ1-ով, BET բրոմոդոմեյնի ինհիբիտորով (BBDI), բուժված քաղցկեղի բջիջների դեղորայքային դիմադրության մեխանիզմը TNBC-ի դեպքում: CRISPR/Cas9-ի միջոցով նրանք պարզել են, որ rb1 գենի հեռացումը TNBC-ին դարձնում է դիմադրողական JQ1 հակաքաղցկեղային դեղամիջոցի նկատմամբ: Հետևաբար, rb1 ֆունկցիան կարևոր է TNBC-ի դեպքում JQ1 դեղամիջոցների նկատմամբ արձագանքի համար: Նրանք նաև հայտնել են, որ պակլիտաքսելը CDK4/6 կինազի/միկրոխողովակների ինհիբիտոր է, և դրա համադրությունը BBDI-ների հետ, ինչպիսին է JQ1-ը, կարող է խոստումնալից թերապևտիկ պատասխաններ տալ դեղորայքային TNBC-ի դեպքում (Ge et al., 2020):
Երկար ոչ կոդավորող ՌՆԹ-ի (lncRNA) տրանսկրիպցիոն լանդշաֆտը, ըստ հաղորդումների, պատասխանատու է TNBC-ի դեպքում նեոադյուվանտ թերապիայի նկատմամբ դիմադրության համար: Այս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ TNBC-ում բարձր արտահայտված են MALAT1 լncRNA հինգ տարբեր տրանսկրիպտներ: Բացի այդ, CRISPR/Cas9-ի միջնորդությամբ MALAT1-ի դելեցիան մեծացրել է TNBC BT-549 բջիջների զգայունությունը պակլիտաքսելի և դոքսորուբիցինի նկատմամբ, ինչը ենթադրում է MALAT1 դիմադրության հնարավոր դերը TNBC-ի դեպքում (Shaath et al., 2021):
BRCA1-ի (BRCA1m) մուտացիաները տարասեռ են և, հետևաբար, դժվար է հայտնաբերել: BRCA1-ի սինթետիկ մահացու զուգընկերոջ՝ PARP1-ի (պոլի(ADP-ռիբոզ) պոլիմերազ) թիրախավորումը կարող է մեծացնել TNBC դեղամիջոցի քիմիաթերապիայի նկատմամբ զգայունությունը: CRISPR/Cas9-ի միջոցով PARP1-ի ջնջումը մեծացրել է հակաքաղցկեղային դեղամիջոցների, ինչպիսիք են դոքսորուբիցինը, գեմցիտաբինը և դոցետաքսելը, զգայունությունը mBRCA1 մուտանտ TNBC բջիջների նկատմամբ, ինչը ենթադրում է, որ PARP1-ը նույնպես ներգրավված է TNBC-ի դեղորայքային դիմադրության մեջ (Vaghari-Tabari et al., 2022): BRCA1 կամ BRCA2 ուռուցքի ճնշող գեների մուտացիաները հայտնի են նրանով, որ մեծացնում են մարդկանց մոտ կրծքագեղձի քաղցկեղի զարգացման հավանականությունը: Այս հիվանդների բուժումը պահանջում է PARP ինհիբիտորների օգտագործում: Բացի այդ, ցույց է տրվել, որ CRISPR/Cas9-ի միջոցով DNPH1 նուկլեոտիդային փրկարար գործոնի նոկաուտը կարող է հեռացնել թունավոր նուկլեոտիդ 5-հիդրօքսիմեթիլդեզօքսիուրիդին (hmdU) մոնոֆոսֆատը, դրանով իսկ ուժեղացնելով BRCA-դեֆիցիտային բջիջների արձագանքը PARP ինհիբիտորների նկատմամբ զգայունությանը (Fugger. et al., 2021): Այսպիսով, CRISPR/Cas9-ը և PARP1 ինհիբիտորները կարող են դառնալ TNBC-ի կարևոր բուժման ռազմավարություն:
Ներթափանցող գլիկոպրոտեինի (P-gp) գենը բազմադեղորայքային դիմադրության գեն է, որը, ընդհանուր առմամբ, ակտիվանում է բոլոր կրծքագեղձի քաղցկեղի (TNBC) մոտ 41%-ում (Sun et al., 2020): P-gp-ով առաջացած դեղերի արտահոսքը նույնացվել է որպես կրծքագեղձի քաղցկեղի դեպքում դեղորայքային դիմադրության հիմնական կարգավորիչ: P-gp ինհիբիտորները ցույց են տվել կրծքագեղձի քաղցկեղի դեպքում հակաքաղցկեղային դեղերի նկատմամբ զգայունության բարձրացում (Famta et al., 2021): Այսպիսով, CRISPR/Cas9-միջնորդավորված աբլացիան կամ P-gp-ի և P-gp ինհիբիտորների ճնշումը կարող են շատ կարևոր մեթոդներ լինել TNBC-ի դեպքում դեղորայքային դիմադրության հաղթահարման համար:
ԱԵՖ-կապող կասետային փոխադրիչ G2-ը (ABCG2) հայտնի է նրանով, որ առաջացնում է դեղորայքային դիմադրողականություն TNBC-ում (Palasuberniam et al., 2015), չնայած ներկայումս չկան հաղորդագրություններ CRISPR/Cas9-ի և ABCG2 լռեցման, ինչպես նաև ուռուցքի ճնշող գեների ինակտիվացման միջև կապի վերաբերյալ: PTEN-ը կարող է ուժեղացնել ABCG2 ակտիվացումը (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021): Հետևաբար, CRISP/Ca9-ի օգտագործումը ABCG2-ը հեռացնելու համար և դրա համադրությունը ABCG2 ինհիբիտորի հետ կարող է լինել հարմար բուժում TNBC-ում դեղորայքային դիմադրողականությունը հաղթահարելու համար: Աղյուսակ 2-ում նշվում է CRISPR/Cas9-ի կողմից բոլոր դիմադրողականության գեների թիրախավորումը:
Աղյուսակ 2. CRISPR/Cas9-ը թիրախավորում է TNBC-ի տարբեր դիմադրության գեները՝ բջիջները հակաքաղցկեղային դեղամիջոցների նկատմամբ զգայունացնելու համար:
CRISPR/Cas9 գրադարանները պոտենցիալ գործիքներ են քաղցկեղի պաթոգենեզի հետ կապված գեների մուտացիաների սկրինինգի համար (Chan et al., 2022): Այս սկրինինգի մեթոդը ներառում է չորս քայլ՝ (ա) գրադարանի կառուցում, (բ) լենտիվիրուսային տրանսդուկցիա, (գ) ֆենոտիպային սկրինինգ և (դ) թիրախային գեների վերլուծություն: Չնայած TNBC-ն ունի MAPK ուղու աննորմալ ակտիվացում, ուռուցքի ճնշող գեների, ինչպիսիք են PTEN, RB1 և TP53, մուտացիաներ կրող TNBC հիվանդների համար MEK թիրախային թերապիայի կլինիկական կանխատեսումը շատ վատ է:
Բացի այդ, CRISPR/Cas9-ի միջոցով գեների նոկաուտի սկրինինգը փորձարկել է ամենաուժեղ և ընտրողական մոլեկուլը՝ դեհիդրոկատրոլը, որը առատ է Գվատեմալայի ծաղիկների և տերևների քաղվածքներում, որպեսզի հասկանանք դեհիդրոկատրոլի ազդեցությունը MDA-MB-231-ի վրա: Ընտրողական բջջային ցիտոտոքսիկության մեխանիզմներ: TNBC ենթատիպերի մեզենքիմալ ցողունային բնութագրեր: Այս CRISPR/Cas9-ի վրա հիմնված սկրինինգը նաև ցույց է տվել, որ HSD17B11-ը, որը կոդավորում է 17β-հիդրօքսիստերոիդ դեհիդրոգենազ տիպ 11, բարձր արտահայտված է MDA-MB-231 բջիջներում և հանգեցնում է MDA-MB-231 բջիջների համար յուրահատուկ դեհիդրոֆալկարինոլի (Grant et. al., 2020): Այսպիսով, սա ենթադրում է, որ CRISPR/Cas9 գենոմային սկրինինգը մեծ ներուժ ունի պոտենցիալ բնական միացությունների հակաքաղցկեղային հատկությունների հիմքում ընկած մեխանիզմները բացահայտելու համար:
Բացի այդ, TNBC-ի քաղցկեղի նկատմամբ խոցելիությունը ուսումնասիրվել է գենոմի լայնածավալ in vivo CRISPR/Cas9 սկրինինգի միջոցով, որը ցույց է տվել կապը ուռուցքածին և ուռուցքի ճնշող ուղիների միջև: mTOR և Hippo ուղիների հիմնական բաղադրիչները, ըստ հաղորդումների, կարևոր դեր են խաղում TNBC-ի ուռուցքի կարգավորման գործում: Բացի այդ, ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ mTORC1/2-ի և YAP օնկոպրոտեինի դեղաբանական արգելակումը արդյունավետորեն արգելակում է TNBC-ի պաթոգենությունը՝ օգտագործելով in vitro դեղամիջոց-մատրից սիներգիայի մոդել և in vivo հիվանդներից ստացված քսենոտրանսպլանտատներ: Ավելին, Torin-1-ի միջնորդությամբ mTORC1/2 արգելակումը ուժեղացնում է մակրոպինոցիտոզը, մինչդեռ վերտեպորֆինով առաջացած YAP արգելակումը հանգեցնում է TNBC բջջային մահվան: Ամփոփելով՝ այս արդյունքները ընդգծում են գենոմի լայնածավալ in vivo CRISPR սկրինինգի հզորությունն ու կայունությունը՝ TNBC-ի նոր և արդյունավետ բուժումներ հայտնաբերելու համար (Dai et al., 2021):
Իմունային համակարգի դիսռեգուլյացիան կարևոր գործոն է ուռուցքագոյացման մեջ: Քաղցկեղի բջիջները խուսափում են իմունային մաքրումից՝ շրջանցելով պաշտպանական մեխանիզմները, այդ թվում՝ խանգարելով ուռուցքի միկրոմիջավայրում իմունային բջիջների ակտիվությանը և խաթարելով իմունային համակարգը: Հետևաբար, բարելավված իմունային համակարգի զարգացումը կարող է լինել ուռուցքների դեմ պայքարի հիմնական մոտեցումը: CRISPR/Cas9-ի վրա հիմնված գեների մոդիֆիկացիայի կիրառումը լուծում է իմունային դիսֆունկցիայի հետ կապված մի շարք խնդիրներ՝ տարբեր տեսանկյուններից: CRISPR/Cas9-ը օգտագործվել է կրծքագեղձի քաղցկեղի դեմ հակաուռուցքային իմունիտետը բարելավելու համար հետևյալ ուղիներով (Նկար 3):
Նկար 3. CRISPR/Cas9 իմունաթերապիան թիրախավորում է TNBC բջիջները: CDK5-ի կորուստը և PDL1-ի և CD155-ի նոկդաունը ուժեղացնում են իմունային համակարգը: Նմանապես, A2AR-ի կորուստը և TAA-ների, ինչպիսիք են HER2-ը, մուցին 1-ը և TEM8-ը, նոկդաունը մեծացրել են CAR-T բջիջների արդյունավետությունը քաղցկեղի բջիջները ոչնչացնելու հարցում: CRISPR/Cas9-ով պայմանավորված T բջիջների սկրինինգը ցույց է տվել, որ p38 կինազի խանգարումը մեծացնում է T բջիջների հակաուռուցքային ակտիվությունը: CRISPR/Cas9-ով մոդիֆիկացված T բջիջները մեծացնում են TCR-ի (T բջջային ընկալիչ) արտահայտությունը, ինչի արդյունքում T բջիջները ունեն հակաուռուցքային ակտիվություն:
Իմունաթերապիայի նպատակն է խթանել իմունային համակարգը՝ հարձակվելու քաղցկեղի բջիջների վրա: Իմունային ստուգիչ կետերի սպիտակուցների գերարտահայտումը սովորաբար կանխում է աուտոիմունային ռեակցիաները, բայց կարող է օգնել քաղցկեղներին խուսափել դրանցից (Topalian et al., 2015): Այս սպիտակուցները կանխում են իմունային ռեակցիաները՝ կապվելով իմունային բջիջների մակերեսին գտնվող ընկալիչների հետ: Բազմակի ստուգիչ կետերի սպիտակուցներ (օրինակ՝ CD155 և PD-L1) թիրախավորում են իմունային բջիջների PD-1 ընկալիչը և արտահայտվում են կրծքագեղձի քաղցկեղի, մասնավորապես՝ կրծքագեղձի քաղցկեղի (TNBC) դեպքում (Li Y.-C. et al., 2020): PD-L1-ի կամ դրա ընկալիչի նոկդաունը՝ օգտագործելով CRISPR/Cas9-ը, կարող է խթանել իմունային համակարգը՝ հարձակվելու TNBC ուռուցքների վրա (Yahata et al., 2019): Բացի այդ, CRISPR/Cas9-ի միջնորդությամբ CDK5-ի ջնջման միջոցով PD-L1 արտահայտման նվազումը, ինչպես ցույց է տրվել, in vitro և in vivo պայմաններում կանխում է ուռուցքի աճը (Deng et al., 2020): Կրծքագեղձի քաղցկեղի in vitro և in vivo մոդելներում աճի արգելակումը ենթադրում է, որ shRNA-միջնորդավորված CD155-ի նվազումը կարող է թերապևտիկ ազդեցություն ունենալ կրծքագեղձի քաղցկեղի վրա (Gao et al., 2018):
CAR T բջիջները արտահայտում են ուռուցքի հետ կապված հակածիններ (TAA) ճանաչող CAR-ներ և կարող են օգտագործել ստուգիչ կետերի սպիտակուցների նոկդաունը՝ իրենց ակտիվությունը բարձրացնելու համար (Li C. et al., 2020): Կրծքագեղձի քաղցկեղի դեպքում CAR T բջջային թերապիայի համար կան տարբեր պոտենցիալ թիրախներ, այդ թվում՝ մի քանի TAA-ներ, ինչպիսիք են HER2-ը, մուցին1-ը և TEM8-ը (Bajgain et al., 2018): Կան ապացույցներ, որ մեզոթելինին թիրախավորող CAR T բջիջները (որոնք գերարտահայտված են TNBC BT-459 բջիջներում) ավելի արդյունավետ են քաղցկեղի դեմ, երբ PD-1-ը նոկաուտի է ենթարկվում CRISPR/Cas9-ի միջոցով (Hu et al., 2019): Այնուամենայնիվ, հիվանդներից T բջիջների մեկուսացումը և այնուհետև դրանց ex vivo խմբագրումը աշխատատար և ժամանակատար գործընթաց է: Չնայած ունիվերսալ T բջիջները կարող են նվազեցնել մեկուսացման պահանջները, մարդու լեյկոցիտային հակածին (HLA) I դասի և T բջջային ընկալիչ (TCR) արտահայտող դոնոր T բջիջները պետք է հեռացվեն՝ պատվաստն ընդդեմ հյուրընկալողի անոմալիաները կանխելու համար (Ren et al., 2017): , 2017a): CRISPR/Cas9-ի միջոցով HDR-ը կարող է միաժամանակ վերացնել TCR-ը և HLA-ն և չեզոքացնել CAR կոդավորող գենը: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ CRISPR/Cas9-ը կարող է օգտագործվել հակա-CD19 CAR-ները TCR լոկուսի մեջ ներմուծելու համար, այդպիսով արդյունավետորեն արտադրելով CAR-ներ՝ առանց T բջիջները սպառելու (Dimitri et al., 2022): Մշակվել են մուլտիպլեքսային տեխնոլոգիաներ՝ ալոգեն CAR T բջիջներ ստեղծելու համար՝ միաժամանակ վերացնելով TCR-ը, բետա-2-միկրոգլոբուլինը (B2M), HLA-I ենթամիավորը և այլ սպիտակուցներ, ինչպիսիք են PD-1-ը և CTLA-4-ը, որոնք կարող են ունենալ ավելի մեծ հակաքաղցկեղային հատկություններ TNBC-ի դեմ (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022):
CRISPR/Cas9-ի կիրառումը կարող է բարելավել CAR-T բջիջների արդյունավետությունը: Ադենոզինը հայտնի է իր իմունոսուպրեսիվ հատկություններով և կարող է նվազեցնել քաղցկեղի դեմ իմունիտետը՝ T բջիջների ֆունկցիան արգելափակելով և ադենոզին A2A ընկալիչները (A2AR) ակտիվացնելով (Vigano et al., 2019): A2AR-ի լռեցումը CRISPR/Cas9-ի միջոցով զգալիորեն բարելավել է CAR-T բջիջների արդյունավետությունը in vivo (Giuffrida et al., 2021): T բջիջները հայտնի են տարբեր ֆենոտիպային բնութագրերով, ինչպիսիք են բջջային ընդլայնումը, դիֆերենցիացիան, օքսիդատիվ սթրեսը և գենոմային սթրեսը: CRISPR/Cas9-ի վրա հիմնված T բջիջների սկրինինգը բացահայտել է 25 տարբեր T բջջային ընկալիչ կինազների խանգարում: Դրանց թվում, p38 կինազի ջնջումը, ինչպես ցույց է տվել ջնջումը, ուժեղացնում է T բջիջների հակաուռուցքային ակտիվությունը, ինչը ցույց է տալիս, որ p38 կինազը CAR-T բջիջների կարգավորման հիմնական կարգավորիչն է (Gurusamy et al., 2020):
T բջիջները կարող են գենետիկորեն մոդիֆիկացվել CRISPR/Cas9-ի միջոցով՝ բարձր արտահայտված TCR-ներ ստանալու համար: Գենետիկորեն մոդիֆիկացված T բջիջների հիվանդներին փոխանցումը ցույց է տվել ավելի ուժեղ հակաքաղցկեղային ակտիվություն, քան էնդոգեն T բջիջները: Հետևաբար, էնդոգեն TCR-ները կարող են մրցակցել հիվանդների մոտ գենետիկորեն մոդիֆիկացված TCR-ների հետ, ինչը կարող է ազդել քաղցկեղի իմունաթերապիայի ներուժի վրա: Այս խնդիրը հաղթահարելու համար CRISPR/Cas9-ի օգտագործումը՝ ռեցիպիենտ բջիջներից էնդոգեն TCR-β հեռացնելու և հետագայում TCR-β T բջիջները քաղցկեղով հիվանդներին փոխանցելու համար, կարող է ցուցաբերել ավելի լավ հակաքաղցկեղային իմունային պատասխաններ՝ առանց էնդոգեն TCR սեռական մրցակցության անհրաժեշտության (Fan et al. 2018): Այսպիսով, բացառությամբ CRISPR-ով մոդիֆիկացված T բջիջների, TCR-ները հազար անգամ ավելի զգայուն են ուռուցքային հակածինների նկատմամբ, քան նորմալ TCR-ով տրանսդուկցված T բջիջները: Բացի այդ, տարբեր լեյկեմիաների դեպքում γδ TCR+ CRISPR-ի կողմից առաջացած մոդիֆիկացված T բջիջները ցուցաբերում են CD4+ և CD8+ T բջիջների ավելի բարձր արտահայտում, քան ստանդարտ TCR փոխանցումը (Legut et al., 2018): Այսպիսով, CRISPR/Cas9-ի միջոցով ստեղծված մոդիֆիկացված T բջիջները կարող են լինել արդյունավետ իմունաթերապիայի մեթոդ՝ TNBC-ն հաղթահարելու համար։
Ինտեգրինները բջջային ադհեզիայի մոլեկուլներ են, որոնք առկա են բջջային տրանսմեմբրաններում և նպաստում են բջիջների կապմանը արտաբջջային մատրիցի (ECM) հետ (Hamidi and Ivaska, 2018): Ինտեգրինների դիսռեգուլյացիան կապված է քաղցկեղի զարգացման և միգրացիայի հետ՝ փոփոխելով արտաբջջային մատրիցը, ինչը հանգեցնում է քաղցկեղի բջիջների գոյատևմանը արյան մեջ (Hamidi and Ivaska, 2018): CRISPR/Cas9-ի միջնորդությամբ ինտեգրինի նոկդաունը դանդաղեցնում է ուռուցքի առաջընթացը, մետաստազը և գաղութացումը TNBC-ում: Ինտեգրին a5-ի (ITGA5) նոկդաունը, ըստ հաղորդումների, նվազեցնում է բջիջների միգրացիան և առաջընթացը այլ քաղցկեղների, ինչպիսին է թոքերի քաղցկեղը (Ju et al., 2017), ինչը ենթադրում է, որ ինտեգրին a5-ը նույնպես կարող է լինել TNBC-ի ախտածագման հիմնական գործոն:
Ավանդական սաղմնային ցողունային (ES) բջիջների մեթոդներով նոկաուտ մկների ստացումը աշխատատար, ժամանակատար և անարդյունավետ գործընթաց է: ES բջիջները հոմոլոգ ռեկոմբինացիայի միջոցով թիրախավորելու, քիմերային մկներ բուծելու, ապա դրանք հետերոզիգոտ մկների հետ խաչասերելու համար անհրաժեշտ են ամիսներ և տարիներ՝ հոմոզիգոտ սերունդ ստանալու համար: Բազմակի գենետիկ մուտացիաներով մկներ ստեղծելու համար անհրաժեշտ է բարդ խաչասերում: Այնուամենայնիվ, բազմաթիվ խնդիրներ են առաջացել ES բջիջների CRISPR/Cas9-ի միջոցով աբլացիայի կամ CRISPR/Cas9 բաղադրիչները միաբջիջ բեղմնավորված ձվաբջիջների մեջ միկրոներարկելու միջոցով ստացված մկների օգտագործման ժամանակ: Օրինակ, փոփոխությունների ներմուծումը հաճախ տեղի է ունենում երկալելային լոկուսներում և գենային սպեցիֆիկ չէ: Վերջերս հաղորդվել է, որ CRISPR/Cas9 տեխնոլոգիան օգտագործող ES բջիջները կարող են միաժամանակ երկալելային մուտացիաներ ներմուծել մինչև 5 գեներում (Nishizono et al., 2021): Այս նպատակով Cas9 mRNA-ն և հինգ գե-սպեցիֆիկ gRNA-ն միաժամանակ տրանսֆեկտվել են ES բջիջների մեջ: Սա ընդգծում է այս ընթացակարգի խոստումնալիցությունն ու արդյունավետությունը, չնայած այս մուտացիաները կարող էին փոխանցվել, երբ հիմնադիր գծերը բուծվել են հնգակի նոկաուտ մկներ ստանալու համար: Ուսումնասիրությունը նաև ներկայացնում է զարմանալի հայտնագործություն. ES բջիջները այլևս անհրաժեշտ չեն գենետիկորեն մոդիֆիկացված մկներ ստեղծելու համար: Դրա փոխարեն, որոշակի գենային արգասիքներ հեռացնելու համար, Cas9 mRNA-ն և gRNA-ն ներարկվել են միաբջիջ փուլի սաղմերի մեջ: Արդյունքում ստեղծվել են նոկաուտ հիմնադիր գծեր, որոնք տեսականորեն կարող են օգտագործվել մկների մոտ գեների ջնջման հետևանքները ուսումնասիրելու համար (Qin et al., 2016): Այսպիսով, CRISPR/Cas9-ը թույլ է տալիս ստեղծել տրանսգենային մկներ՝ TNBC-ն բուժելու համար ավանդական գենետիկական ինժեներիայի համեմատ ավելի ցածր գնով: CRISPR/Cas համակարգի միջոցով մշակվել է նոկաուտ մկան նոր մոդել, որը կարող է հաջողությամբ կետային մուտացիաներ ներմուծել TNBC-ի մեկ կամ մի քանի էնդոգեն գեներում: Այս հայեցակարգի հիման վրա, TNBC-ի կենդանական մոդելները կարող են մշակվել նաև CRISPR/Cas9-միջնորդավորված BRCA1-ի և p53-ի ջնջման միջոցով, ինչը հանգեցնում է HR վերականգնման կորստի, գենոմային անկայունության և մուտանտային ֆենոտիպերի (Annunziato et al., 2020):
Ներկայումս կրծքագեղձի քաղցկեղի ախտորոշման համար օգտագործվում են տարբեր մեթոդներ, ինչպիսիք են մամոգրաֆիան, մագնիսական ռեզոնանսային պատկերացումը (ՄՌՏ) և ուլտրաձայնային հետազոտությունը: Այնուամենայնիվ, այս մեթոդներն ունեն որոշ սահմանափակումներ: Մամոգրաֆիան օգտագործվում է կրծքագեղձի տեղային հյուսվածքը ախտորոշելու համար, այլ ոչ թե մետաստազները, որտեղ քաղցկեղի բջիջները գաղթել են այլ օրգաններ: Ուլտրաձայնային հետազոտությունը կրծքագեղձի քաղցկեղի ախտորոշման հուսալի մեթոդ չէ (Չեն և Լի-Ֆելկեր, 2023): ՄՌՏ-ն ավելի բարձր զգայունություն ունի, քան ուլտրաձայնային հետազոտությունը և մամոգրաֆիան, բայց դրա ախտորոշիչ ճշգրտությունը սահմանափակ է (Շա և Չեն, 2022): Հյուսվածքային բիոպսիան քաղցկեղի բջիջները հայտնաբերելու ինվազիվ միջոց է: Այնուամենայնիվ, որոշ դեպքերում բիոպսիան կարող է բաց թողնել քաղցկեղային հյուսվածքը, եթե ասեղը շեղվի հետաքրքրության տարածքից: Բացի այդ, այն շատ թանկ է և կարող է տրավմատիկ լինել հիվանդի համար: Կրծքագեղձի քաղցկեղը քաղցկեղի տարասեռ տեսակ է, ուստի բիոպսիան կարող է բավարար տեղեկատվություն չտրամադրել քաղցկեղի տեսակի մասին: Հետևաբար, շտապ անհրաժեշտ է նոր ախտորոշիչորեն հուսալի մեթոդ կրծքագեղձի քաղցկեղի հայտնաբերման համար: CRISPR/Cas9-ը կարող է ծառայել որպես կրծքագեղձի քաղցկեղի ախտորոշման բարձր զգայուն և նվազագույն ինվազիվ այլընտրանք: Այս նպատակով, CRISPR/Cas9-ի վրա հիմնված ռազմավարությունները կարող են օգտագործվել TNBC ախտորոշման ՊՇՌ մեթոդները բարելավելու համար: Նախ, CRISPR համակարգի Cas9 և cpf1 սպիտակուցներն օգտագործվում են ոչ սպեցիֆիկ ԴՆԹ-ն հեռացնելու համար, ապա այս երկու սպիտակուցները (Cas9 և cpf1) կարող են ճանաչել PAM հաջորդականությունը՝ նախքան թիրախային ԴՆԹ-ին կապվելը (Deepak Singh et al., 2021): Այսպիսով, ՊՇՌ-ն կարող է բացահայտել քաղցկեղի զարգացման հետ կապված մուտացիաները: Մի շարք ուսումնասիրություններ կիրառել են այս CRISPR-ի վրա հիմնված ռազմավարությունը՝ տարբեր քաղցկեղների տարբեր մուտացիաներ հայտնաբերելու համար (Safari et al., 2019): Այսպիսով, CRISPR-ի վրա հիմնված ՊՇՌ մեթոդները կարող են նվազեցնել TNBC ախտորոշման կախվածությունը ինվազիվ մեթոդներից, ինչպիսիք են բիոպսիայի վրա հիմնված իմունահյուսվածքաքիմիան:
Հորմոնալ ընկալիչների կարգավորման գենոտիպային փոփոխություններ են հայտնաբերվել նաև տրանսնեյրոքիմիական նեֆրիտի (ՏՆԲՔ) դեպքում (Chen and Russo, 2009): CRISPR/Cas9-ի վրա հիմնված ՊՇՌ ռազմավարությունները, որոնք օգտագործում են միկրոմատրիցներ՝ բժշկական օգնության կետերում ախտորոշման համար, կարող են արդյունավետորեն վերահսկել այս մուտացիաները (Hajian et al., 2019): Այն նաև կարող է առողջապահական ծառայություններ մատուցողներին տրամադրել ՏՆԲՔ հիվանդների մոտ որոշակի մուտացիաների վերաբերյալ համապատասխան տեղեկատվություն, ինչը կարող է օգնել բարելավել նրանց բուժման ընթացքը: Այնուամենայնիվ, այս համակցված տեխնիկան ունի սահմանափակումներ: Հետևաբար, անհրաժեշտ են լայնածավալ հետազոտական ​​​​ջանքեր, նախքան այս CRISPR/Cas-PCR մեթոդը կարող է օգտագործվել առողջապահության մեջ ՏՆԲՔ ախտորոշման համար (Yang et al., 2019):